一种流感病毒亚单位疫苗纯化方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种含有四步纯化工艺的流感病毒亚单位疫苗的制备方法和由所述方法制备得到的疫苗，本发明专利技术提供的流感病毒亚单位疫苗四步纯化工艺，弥补了现有技术中三步纯化工艺的不足，既降低了疫苗中卵清蛋白的含量，又增强了病毒裂解效果，提高了HA等有效抗原物质的含量。 1

A purification method of Subunit Influenza Vaccine and its application

The invention provides a preparation method of a Subunit Influenza Vaccine containing a four step purification process and a vaccine prepared by the method. The four step purification process of the invention provided by the invention makes up for the deficiency of the three step purification process in the existing technology and reduces the content of the ovalbumin in the vaccine. It also enhanced the cracking effect of the virus and increased the content of effective antigen substances such as HA. One

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒亚单位疫苗纯化方法及其应用
本专利技术属于医药领域，涉及一种流感疫苗的制备方法及利用该方法制备得到的疫苗。
技术介绍
流行性感冒病毒(influenzavirus，简称流感病毒)，是一种引起人、禽、畜共患的急性呼吸道传染病。根据病毒表面血凝素和神经氨酸酶结构及其基因特性的不同分为许多亚型，目前已发现的血凝素有16个亚型(H1～H16)，神经氨酸酶有10个亚型(N1～N10)。接种流感疫苗是预防流感发生与传播的最佳方法。流感病毒亚单位疫苗是用裂解剂将病毒裂解而制得，疫苗中含有血凝素/神经氨酸酶表面抗原和其它抗原，病毒包膜被破坏，脂质被去除，具有较高的免疫原性，副反应较低，可用于儿童、成人和老年人。在目前的流感病毒亚单位疫苗生产中，纯化工艺一般包括三步：流感病毒裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化和最终的洗滤纯化，或者是，流感病毒裂解时纯化、裂解后纯化和最终洗滤纯化，只注重病毒裂解前的纯化而忽略了裂解过程中的纯化，虽然降低卵清蛋白等杂质，但是忽略了使裂解剂与病毒充分接触，从而影响了病毒裂解效果，同时因为无法使裂解下来的HA和NA进入到相应密度的蔗糖区间，进而无法在裂解时对HA和NA起到富集和纯化作用；只注重病毒裂解过程中的纯化而忽略了裂解前的纯化，虽然增强了流感病毒的裂解效果和裂解过程中对有效抗原物质HA和NA的富集、纯化作用，但是忽略了对卵清蛋白等杂质的进一步去除。例如，在现有技术CN102068692A、CN103520716A、CN106668854A中公开了的流感裂解疫苗制备方法中，采用的是流感病毒裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化和最终的洗滤纯化，现有技术CN104888212A中公开了的流感裂解疫苗制备方法中，采用了流感病毒裂解时纯化、裂解后纯化和最终洗滤纯化的纯化方式。通过三步纯化工艺能够大大降低流感病毒亚单位疫苗中的卵清蛋白、裂解剂和甲醛等杂质的含量，减少不良反应的发生，提高疫苗的安全性。但是疫苗中的卵清蛋白等杂质不可能完全去除，因而，需要在研发过程中不断改进工艺方法，尽可能的降低杂质的含量，提高有效抗原物质含量，不断提高产品的安全性和有效性。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种可以降低杂质和提高有效抗原物质的流感疫苗制备方法。本专利技术提供了一种流感疫苗制备方法，所述的制备方法采用了四步纯化工艺。一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，所述方法的步骤包括：(1)病毒的增殖、浓缩；(2)病毒裂解前纯化；(3)病毒的裂解；(4)裂解液的纯化；(5)裂解液的灭活；(6)灭活液的洗滤纯化。所述的步骤(2)病毒裂解前纯化所用方法为密度梯度离心法；所述的步骤(3)病毒的裂解为病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行。优选的，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。具体的，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：1)配制蔗糖浓度梯度溶液，启动超速离心机，抽真空，排气泡，制作蔗糖密度梯度；2)加入病毒浓缩液，同时，对病毒浓缩液进行离心；3)病毒浓缩液加完后，加入液体进行循环；4)收集目标液。在本专利技术的具体实施例中，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：1)分别配制浓度为10％～20％、25％～35％、50％～60％的蔗糖溶液，启动超速离心机，在2000～4000rpm，15～25℃条件下抽真空，加入PBS或水或生理盐水排转子中气泡，依次加入浓度为10％～20％、25％～35％、50％～65％的蔗糖溶液制作蔗糖密度梯度；2)设定转速20000～30000rpm、温度0～25℃、加入病毒浓缩液，控制流速为25～45ml/min，上样体积为3-7L/台次；3)进样全部完毕后，加入PBS或水或生理盐水进行循环，循环时间为40～80min；4)将离心机转速降到2000～4000rpm，20～60min后，从边孔打入蔗糖溶液，从中孔出液，收集目标液。所述的步骤(3)病毒的裂解中具体采用病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行的方式，所述的蔗糖密度梯度离心液中含有蔗糖溶液与裂解剂。所述的步骤(3)病毒的裂解中包括：1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。优选的，所述的步骤(3)病毒的裂解中包括：1)配制裂解剂，启动超速离心机，抽真空，排气泡，制作蔗糖密度梯度2)加入步骤(2)得到的收集液，同时，对收集液进行离心；3)收集液加完后，加入液体进行循环；4)收集目标液。所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤1)配制裂解剂时，用浓度为10％～60％蔗糖溶液为溶剂配制浓度为0.1％～1.5％裂解剂，优选的，所述的配制得到裂解剂的浓度为1.5％。所述的裂解剂为TritonX-100和/或TritonN-101，优选的，所述的裂解剂为TritonN-101。所述的裂解剂中的溶剂为蔗糖溶液，优选的，所述的溶剂为15％～60％蔗糖溶液，例如，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％的蔗糖溶液。所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤2)上样与离心中，在加入步骤(2)得到的收集液的同时对收集液进行离心，加入收集液时的流速为25～45ml/min，上样体积为3-7L/台次，优选的，加入收集液时的流速为30～40ml/min，上样体积为4-6L/台次，在20000～30000rpm、0～25℃条件下离心，优选的，在25000rpm、20℃条件下离心。所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤3)加入液体进行循环中，收集液加完后，加入液体进行循环，循环时间为40～80min，优选的，循环时间为60min，所述的液体为PBS或水或生理盐水，优选的，所述的液体为PBS。所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤4)收集目标液中，将离心机转速降到2000～4000rpm，20～60min后，优选的，将离心机转速降到3000rpm，30min后注入质量百分比为40％～60％的蔗糖溶液，优选的，注入质量百分比为50％～60％的蔗糖溶液，更优选的，注入质量百分比为60％的蔗糖溶液，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为5％～30％之间的蛋白峰，优选的，收集蔗糖浓度为6％～25％之间的蛋白峰，更优选的，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰。所述的步骤(3)病毒的裂解中，制作的蔗糖密度梯度溶液中含有裂解剂，使病毒裂解与密度梯度离心同时进行。当血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)被裂解下来后，立刻进入相应的蔗糖区间，一方面流感病毒的有效抗原物质血凝素和神经氨酸酶进入到固定蔗糖区间，对血凝素和神经氨酸酶起到富集的作用，使流感病毒有效抗原物质得到纯化；另一方面病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行，既使病毒得到充分裂解，又减少了工艺程序和时间，降低了时间成本和人力成本。优选的，所述的步骤(4)裂解液的纯化中是以凝胶层析，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析中的一种或者两种以上的方法进行纯化。优选的，所述的步骤(4)裂解液的纯化中是以凝胶层析法进行纯化。优选的，所述的步骤(6)灭活液的洗滤纯化是对病毒灭活液进行洗滤去除杂质。在本专利技术的实施方式中，所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中包括：1)工作种子批毒种稀释；2)接种；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，所述方法的步骤包括：(1)病毒的增殖、浓缩；

【技术特征摘要】
1.一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，所述方法的步骤包括：(1)病毒的增殖、浓缩；(2)病毒裂解前纯化；(3)病毒的裂解；(4)裂解液的纯化；(5)裂解液的灭活；(6)灭活液的洗滤纯化，其特征在于，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化所用方法为密度梯度离心法，所述的步骤(3)病毒的裂解为病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行。2.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。3.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(3)病毒的裂解中包括：1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。4.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(4)裂解液的纯化中是以凝胶层析，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析中的一种或者两种以上的方法进行纯化。5.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(6)灭活液的洗滤纯化是对病毒灭活液进行洗滤去除杂质。6.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：安有才，徐奇，张玉辉，于海龙，陈辉黎，冷文娜，张宏栋，张焕，陈晓芬，张慧萍，刘鹏，安蕊，刘冰冰，
申请(专利权)人：江苏中慧元通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32