一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。具体由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得所述H7亚型禽流感DNA疫苗。本发明专利技术首先获得H7亚型禽流感病毒的HA基因序列，再根据鸡的密码子偏嗜性进行密码子优化，获得优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示；然后以该优化的optiHA基因与真核表达载体连接构建质粒，并表达获得H7亚型禽流感DNA疫苗。所述H7亚型禽流感DNA疫苗能够预防家禽H7亚型禽流感，减少感染，对养殖业与人类健康具有十分重要的意义。

A H7 subtype avian influenza DNA vaccine and its preparation method

The present invention discloses a H7 subtype avian influenza DNA vaccine and its preparation method. The H7 subtype avian influenza DNA vaccine was obtained by expressing the plasmid constructed by the HA gene of the H7 subtype avian influenza virus and the eukaryotic expression vector. The invention firstly obtained HA gene sequence of H7 subtype avian influenza virus in chicken, then according to the codon bias of codon optimization, get the optimized optiHA gene sequences such as SEQ ID NO.4 shown; then to the optimization of the optiHA gene and the eukaryotic expression vector constructed plasmid, and the expression of H7 DNA subtype avian influenza vaccine. The H7 subtype avian influenza DNA vaccine can prevent avian influenza from H7 subtype in poultry and reduce infection. It is of great significance for the breeding industry and human health.

【技术实现步骤摘要】
一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法
本专利技术属于疫苗
更具体地，涉及一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。
技术介绍
目前，制约家禽养殖业快速发展的关键疫病因素依然是禽流感疫情的预防与控制。禽流感（Avianinfluenza,AI）是禽类感染A型流感病毒引起的疾病综合征(甘孟侯等，1995；高福等，1999)，为区分不同亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）对禽类致病性和毒力，可将禽流感分为低致病性禽流感（LowPathogenicAvianinfluenza，LPAI）和高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianinfluenza，HPAI）。它的暴发给养禽业造成了巨大的经济损失。与此同时对人类的健康产生重大的影响。近年来，禽流感疫情在世界范围内表现出高频多发的特点。目前，H7N9亚型流感疫情暴发呈现出季节性。过去几年内新发现的感染病例均有活禽暴露史(Lametal.,2015；Tanneretal.,2015；Xieetal.,2015)。虽然之前在家禽中有分离到H7N9亚型禽流感病毒，但并没有出现感染人的情况。目前在中国暴发的H7N9亚型流感病毒不但会感染家禽而且还会感染人。近两年，H7N9亚型流感病毒感染人的数量比H5N1亚型禽流感病毒感染人的数量多，且H7N9亚型禽流感病毒貌似更容易感染不同年龄段的人群。基因分析结果表明该病毒对哺乳动物具有更大的威胁(Tanneretal.,2015)。2016年新发现的H7N9亚型禽流感也再次警示着新流感疫情的暴发，2017年H7N9禽流感疫情可能为近四年最为严重的一年。因此，必须高度重视禽流感，禽流感的的防治及疫苗的研究已成为当务之急。虽然疫苗控制禽流感仍存在社会争议，但疫苗结合其他防控措施在控制扩散和清除禽流感疫情方面有着良好的临床表现，疫苗接种仍是防控禽流感的保守措施之一。禽流感疫苗临床应用表现良好，但仍存在负面影响和潜在威胁。为解决这些问题，新型的禽流感疫苗的应用有待继续深入探索和研发。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有禽流感疫苗的缺陷和不足，提供一种由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体组成的H7亚型禽流感DNA疫苗，该疫苗能够预防家禽H7亚型禽流感，减少感染，对养殖业与人类健康具有十分重要的意义。本专利技术的目的是提供一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，由禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得。具体地，所述禽流感病毒HA基因为H7亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/J133/2013(H7N9)的HA基因，序列如SEQIDNO.3所示。具体地，所述H7亚型禽流感病毒的HA基因序列经过密码子优化，优化的optiHA基因序列如SEQIDNO.4所示。具体地，所述真核表达载体为限制性内切酶SacI、XhoI同时酶切质粒pCAGGK（卡纳抗性）得到的载体片段。所述真核表达载体质粒pCAGGK（质粒基因图谱见图4）是在载体pCAGGS基础上改造而来，具体是由本课题组（华南农业大学禽病研究室）构建并保存。更具体优选地，所述H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1.获取野生H7亚型禽流感病毒的HA基因，其序列如SEQIDNO.3所示（序列如图2和图3中Original所示）；S2.将H7亚型禽流感病毒的HA基因根据鸡的密码子偏嗜性进行优化，优化的optiHA基因序列如SEQIDNO.4所示（序列如图2和图3中Optimized所示）；S3.用内切酶SacI和XhoI分别酶切处理optiHA基因与真核表达载体；S4.回收酶切后的目的片段与载体片段，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取质粒并进行酶切鉴定；S5.步骤S4获得的阳性质粒表达获得H7亚型禽流感DNA疫苗。其中，优选地，步骤S3所述酶切的反应体系为：5μL10×buffer、5μL阳性质粒、2μL内切酶SacI、2μL内切酶XhoI、ddH2O36μL补足50μL。优选地，步骤S4所述连接的反应体系和反应条件为：1μLT4DNA连接酶buffer、1μLT4DNA连接酶（5U/μL）、1μL空载体DNA片段（50ng/μL）、7μLoptiHA基因片段；依次将上述试剂震荡混匀后，16℃水浴4-8h。优选地，步骤S4所述筛选阳性菌落所使用时鉴定PCR的引物为J133-F和J133-R，序列如SEQIDNO.1和2所示。另外，由上述方法制备获得的H7亚型禽流感DNA疫苗，以及该DNA疫苗在制备预防或免疫治疗H7亚型禽流感的疫苗或药物方面的应用，以及以DNA疫苗为主要活性成分制备的预防或免疫治疗H7亚型禽流感的疫苗或药物，均应在本专利技术的保护范围之内。另外，上述优化的H7亚型禽流感HA基因（optiHA基因），其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，也在本专利技术的保护范围之内。该优化的optiHA基因在制备H7亚型禽流感DNA疫苗方面的应用也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术获得了一种由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体组成的H7亚型禽流感DNA疫苗，该疫苗能够预防家禽H7亚型禽流感，减少感染，对养殖业与人类健康具有十分重要的意义。本专利技术的DNA疫苗与现有的传统灭活疫苗相比，其副作用少，安全性高，无需佐剂，免疫应答持续时间长，可因应病毒变种而做出快速应对。附图说明图1为本专利技术J133病毒HA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，该图中M：DS2000；1、2：J133病毒HA基因。图2为优化前后HA核苷酸对比；Original为未优化的HA基因序列；Optimized为优化后的optiHA基因序列；下划线标注的为优化后基因与未优化基因的差异碱基位点。图3为优化前后HA核苷酸对比；Original为未优化的HA基因序列；Optimized为优化后的optiHA基因序列；下划线标注的为优化后基因与未优化基因的差异碱基位点。图4为真核表达载体pCAGGK基因图谱。图5为本专利技术质粒pUC-optiHA酶切分析，其中，M：DS5000；1、2：pUC-optiHA/SacI/XhoI。图6为本专利技术质粒pCAGGK-HA酶切分析，其中M：DS5000；1、2：pCAGGK-HA/SacI/XhoI。图7为本专利技术质粒pCAGGK-optiHA酶切分析M：DS5000；1：pCAGGK-optiHA/SacI；2：pCAGGK-optiHA/XhoI；3、4：pCAGGK-optiHA/SacI/XhoI；5：pCAGGK-optiHA。图8为本专利技术H7亚型DNA疫苗质粒在293T细胞中蛋白表达产物Western-blot结果M：蛋白Marker；1：空白对照组；2：空载体pCAGGK组；3：pCAGGK-HA未优化组；4：pCAGGK-optiHA优化组。图9为本专利技术H7亚型禽流感DNA疫苗免疫鸡后HI抗体的变化。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，其特征在于，由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得所述H7亚型禽流感DNA疫苗，所述禽流感病毒HA基因为H7亚型禽流感病毒的HA基因，序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，其特征在于，由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得所述H7亚型禽流感DNA疫苗，所述禽流感病毒HA基因为H7亚型禽流感病毒的HA基因，序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述H7亚型禽流感病毒的HA基因序列根据鸡的密码子偏嗜性进行密码子优化，优化的optiHA基因序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体为限制性内切酶SacI、XhoI同时酶切质粒pCAGGK得到的载体片段。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.获取野生H7亚型禽流感病毒的HA基因，其序列如SEQIDNO.3所示；S2.将H7亚型禽流感病毒的HA基因根据鸡的密码子偏嗜性进行优化，优化的optiHA基因序列如SEQIDNO.4所示；S3.用内切酶SacI和XhoI分别酶切处理optiHA基因与真核表达载体；S4.回收酶切后的目的片段与载体片段，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦培荣，欧阳国文，廖明，王念晨，张友，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44