一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括：1).驯化种毒和MDCK细胞；2).取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×10

Method for producing recombinant avian influenza virus inactivated vaccine by suspension cells

The present invention relates to a method for the production of recombinant avian influenza virus inactivated vaccine by a suspension cell, including: 1). Domesticated species and MDCK cells; 2). Taking the suspended MDCK cells cultured in a shake flask and gradually amplifying the culture until the final stage reactor; the cell density of the final stage reactor reaches 8 * 10.

【技术实现步骤摘要】
一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法
本专利技术涉及疫苗生产
，具体而言，涉及一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法。
技术介绍
禽流感(AvianInfluenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类病毒性疾病，被国际兽医局(OIE)确定为类烈性传染病。鸡流感首次报道于1878年(意大利)。1955年证明鸡流感病毒含有甲型流感病毒的核蛋白，为区别于鸡新城疫，又称真性鸡流感或欧洲鸡流感病毒，实际上就是禽流感病毒(AIV)，其所引起的疾病称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。该病毒广泛分布于世界各地，高致病力毒株可引起70％以上的死亡率；禽流感的每一次爆发，都会给养禽业带来巨大的经济损失，现已成为危害全球养殖业的第一大疫病。1997年的香港禽流感事件造成了18人感染，6人死亡。截止到2008年底，共有15个国家393人感染AIV，其中247人死亡。说明AIV有向人类蔓延的趋势，严重威胁公共卫生安全和人类健康，引起世界范围的高度重视，迫切需求切实有效的禽流感疫苗出现。为防止禽流感发生，我国及其他一些国家，采取了给家禽广泛接种灭活疫苗的防制措施。疫苗免疫是预防禽流感疫情的重要措施和有效途径。高致病性禽流感主要由H5和H7亚型引起。除少数病例外，人禽流感主要由H5N1亚型病毒感染所致。为有效控制高致病性禽流感的发生，我国于2005年实施了强制免疫政策，当年就免疫家禽近69亿羽。我国是世界上的禽类养殖量最大的国家，也是高致病性禽流感的爆发区。今年下半年国家农业部对于禽流感疫苗的免疫做出了新的部署，将H7亚型疫苗纳入强制免疫疫苗的范畴。这就进一步提高了对禽流感疫苗的需求，而本领域目前的重组禽流感病毒灭活疫苗生产工艺还有诸多需要改善的地方。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术涉及一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括：1).驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境；驯化H5亚型重组禽流感病毒或H7亚型的重组禽流感病毒种毒使得其适应全悬浮培养环境下的MDCK细胞培养；2).取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，接种于1L～7L的生物反应器中进行预培养，随后逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×106.0～1.0×107.0个细胞/ml时接入步骤1)中驯化好的病毒进行病毒培养；所述终级反应器为3000L～6000L的生物反应器；3).当CPE达到75％以上时收获病毒液并取样检验病毒质量；将所述病毒液中的病毒纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品；4).将所述疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。本专利技术规范了禽流感疫苗的生产规范，能够流程化地大量、安全、高效、低成本的生产禽流感疫苗，应用MDCK细胞培养流感病毒不仅解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题，而且培养的病毒免疫原性更为稳定。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例中提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统结构示意图。图中：1-连续流离心机；2-中空纤维微滤系统；3-膜包超滤浓缩系统。具体实施方式本专利技术涉及一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括：1).驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境；驯化H5亚型重组禽流感病毒或H7亚型的重组禽流感病毒种毒使得其适应全悬浮培养环境下的MDCK细胞培养；2).取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，接种于1L～7L的生物反应器中进行预培养，随后逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×106.0～1.0×107.0个细胞/ml时接入步骤1)中驯化好的病毒进行病毒培养；所述终级反应器为3000L～6000L的生物反应器；3).当CPE达到75％以上时收获病毒液并取样检验病毒质量；将所述病毒液中的病毒纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品；4).将所述疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。其中，上述工艺可用于H5亚型或H7亚型的禽流感疫苗的制备，或者H5+H7亚型的二价灭活疫苗的制备。在一些实施方式中，在步骤2)中，所述逐步放大培养直至终级反应器的过程中，当细胞密度达到6.0×106.0～9.0×106.0个细胞/ml时转入下一级生物反应器；优选的，每级生物反应器的容积相差3～7倍；更优选为5倍。在一些实施方式中，所述H5亚型重组禽流感病毒为Re-8株，所述H7亚型重组禽流感病毒为H7-Re1株。一、在一些实施方式中，在步骤1)中，所述驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境的方法包括：MDCK细胞用胎牛血清含量为8％的DMEM/F12培养基传代培养3次；用胎牛血清含量为5％的DMEM/F12培养基传代培养5次；用胎牛血清含量为2％的DMEM/F12培养基传代培养5次；用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养7次；用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养6次；用低血清培养基传代培养5次；消化、离心，得到的细胞用低血清培养基以转速为20-30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/L进行换液，待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约4.8×105-5.2×105个细胞/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株；收集细胞，然后采用低血清培养基与无血清培养基的混合液培养，并逐步提高无血清培养基的含量，生长稳定后，得到无血清悬浮培养的MDCK细胞。本专利技术制得的无血清悬浮培养的MDCK细胞，培养后，曲线特征为近“S”型曲线，细胞倍增时间20～22小时，性能优异。本专利技术中低血清培养基和无血清培养基均购自甘肃健顺生物科技有限公司。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基，为市售产品。本专利技术提供的MDCK悬浮细胞的制备方法，通过大量实验逐渐摸索得到，先通过逐步降低血清含量制得低血清贴壁培养的细胞株，再经过逐步增加培养转速，细胞逐渐失去黏附瓶壁的依赖，同时也协调使用胎牛血清转变为新生牛血清，然后再配合逐渐提升无血清培养基的含量进行驯化摇床培养，制得无血清悬浮培养的MDCK细胞。该方法简便，易于工厂化生产。在低血清培养基培养过程中，少量贴壁细胞变圆，并且培养液中有悬浮细胞，继续扩增适应培养。然后先以较低的转速进行培养，为了细胞更好的适应摇床培养，进一步地，以转速为20-30r/min进行摇床培养时的细胞密度为0.8×106-1.2×106cells/ml。由于细胞之间也会存在依赖性以及信息的传导，为了使得细胞更好的适应摇床培养，细胞密度也要适当。进一步地，逐渐提高转速为每次提高转速20-30r/min。通过逐渐提高转速，细胞逐渐失去黏附培养基壁的依赖性。为了更好的使得细胞性能稳定，进一步地，每次转速适应培养3-5代。进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括：1).驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境；驯化H5亚型重组禽流感病毒或H7亚型的重组禽流感病毒种毒使得其适应全悬浮培养环境下的MDCK细胞培养；2).取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，接种于1L～7L的生物反应器中进行预培养，随后逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×10

【技术特征摘要】
1.一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括：1).驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境；驯化H5亚型重组禽流感病毒或H7亚型的重组禽流感病毒种毒使得其适应全悬浮培养环境下的MDCK细胞培养；2).取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，接种于1L～7L的生物反应器中进行预培养，随后逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×106.0～1.0×107.0个细胞/ml时接入步骤1)中驯化好的病毒进行病毒培养；所述终级反应器为3000L～6000L的生物反应器；3).当CPE达到75％以上时收获病毒液并取样检验病毒质量；将所述病毒液中的病毒纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品；4).将所述疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。2.根据权利要求1所述的悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境的方法包括：MDCK细胞用胎牛血清含量为8％的DMEM/F12培养基传代培养3次；用胎牛血清含量为5％的DMEM/F12培养基传代培养5次；用胎牛血清含量为2％的DMEM/F12培养基传代培养5次；用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养7次；用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养6次；用低血清培养基传代培养5次；消化、离心，得到的细胞用低血清培养基以转速为20-30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/L进行换液，待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约4.8×105-5.2×105个细胞/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株；收集细胞，然后采用低血清培养基与无血清培养基的混合液培养，并逐步提高无血清培养基的含量，生长稳定后，得到无血清悬浮培养的MDCK细胞。3.根据权利要求1所述的悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述驯化H5亚型重组禽流感病毒或H7亚型的重组禽流感病毒种毒的方法包括：101).将H5亚型或H7亚型的重组禽流感鸡胚种毒接种于MDCK单层细胞培养，接种量为0.1％-3％，所述重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒效价不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥107.5EID50，所述MDCK单层细胞采用含有TPCK-胰酶的DMEM培养基培养，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于1∶512时收获培养物；102).收获的培养物按照步骤101)接种，以此重复培养，培养至重组禽流感亚型病毒增殖速度稳定，病毒含量≥107.5EID50，得到驯化的重组禽流感亚型病毒。4.根据权利要求1所述的悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述逐步放大培养直至终级反应器的过程中，当细胞密度达到6.0×106.0～9.0×106.0个细胞/ml时转入下一级生物反应器；优选的，每级生物反应器的容积相差3～7倍。5.根据权利要求1所述的悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，在步骤2)中，在所述终级反应器中培养细胞时，控制pH＝7.0±0.2；在稳定pH时需要确定细胞培养基中的主要酸性物质，其方法包括：201)、培养开始前，测定所述细胞培养基的pH值，记为A值；202)、在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的pH值，记为B值；203)、摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，冯玉强，李金祥，朱长动，李莉，王玉红，蒋晓梅，张天舒，
申请(专利权)人：吉林冠界生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22