一种基因编辑系统、表达载体、基因编辑试剂盒及其用途技术方案

本发明专利技术公开了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统将膜融合抑制多肽的编码序列定点整合到细胞的安全港基因，使得膜融合抑制肽表达，而细胞的安全港基因不表达。本发明专利技术对CCR5基因进行敲除，操作简便，耗时短；CCR5基因缺失结合膜融合抑制肽过表达，使细胞能够同时抵御R5以及X4噬性HIV病毒侵染，降低病毒突变机率；膜融合抑制肽编码序列整合CCR5基因位点，能够使膜融合抑制肽长期稳定表达。

Gene editing system, expression vector, gene editing reagent kit and its use

The invention discloses a gene editing system. The gene editing system integrates the encoding sequence of the membrane fusion inhibitory polypeptide to the safe port gene of the cell, which makes the membrane fusion inhibitory peptide expressed, and the cell safety port gene is not expressed. The CCR5 gene is knocked out by the invention, the operation is simple and the time consuming is short. The CCR5 gene deletion binding membrane fusion inhibitory peptide is overexpressed and the cell can simultaneously resist the infection of R5 and X4 phagocytic HIV virus and reduce the probability of the mutation of the virus. The membrane fusion inhibitory peptide coding sequence integrates the CCR5 gene sites, which can make the membrane fusion inhibitory peptide stable for a long time. Expression\u3002

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑系统、表达载体、基因编辑试剂盒及其用途
本专利技术涉及一种基因编辑系统、表达载体、基因编辑试剂盒及其用途。
技术介绍
HIV(艾滋病病毒)是一种能感染人类导致人类免疫缺陷的RNA病毒。人体感染HIV后，会导致免疫缺陷，并引发一系列机会性感染及肿瘤，即获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，严重者可导致死亡。HIV入侵人体后，通过与细胞表面的CD4受体结合，在辅助受体CCR5或者CXCR4的参与作用下，进入CD4T淋巴细胞，在该细胞内增殖复制，使CD4T淋巴细胞大量裂解，病毒从细胞释放到血液形成HIV病毒血症，进而引发更多的CD4T淋巴细胞感染，甚至使免疫系统崩溃。AIDS治疗临床上主要采用联合用药的方式，即俗称“鸡尾酒疗法”的高效抗逆转录病毒疗法——Highlyactiveanti-retroviraltherapy(HAART)。鸡尾酒疗法通常由两种逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂组成，其利用不同靶标、不同作用环节的抗HIV药物的协同作用，有效地抑制HIV在人体内的复制和增殖过程，大大降低了AIDS的发病率和死亡率，延长了患者寿命。但现有的大多数蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂被发现无法完全清除体内的HIV病毒，并且长期用药还易导致药物毒副作用、病毒耐药性突变，以及高昂的治疗费用等突出问题，以上各种原因都会使得患者用药依从性差，而患者一旦停药，就失去了目前唯一的治疗机会。面对艾滋病全球蔓延的形势以及现有药物的局限性，临床上迫切需要高效低毒、使用方便、价格便宜的新型抗HIV药物及治疗方案。HIV病毒只有在进入宿主细胞内才能进行复制，所以逆转录酶和蛋白酶抑制剂都是在病毒进入细胞后才发挥作用的，而HIV进入抑制剂能够阻止病毒进入细胞，在病毒复制前就发挥抗病毒作用，因而对耐受前两类抗HIV药物的病毒依然有效，并可组成更多的“鸡尾酒”方案用于艾滋病的治疗。因此，开发新的阻止HIV病毒进入靶细胞的HIV进入抑制剂已经成为目前抗艾滋病药物研发的热点。恩夫韦肽(T20)就是其中一种，是针对HIV膜蛋白gp41设计的，它能够特异性结合gp41，从而抑制病毒包膜和细胞膜的融合，阻止HIV侵入人体内正常细胞。在T20的基础上，我国自主研发出一个全新的多肽分子，西夫韦肽，据资料显示该药与T20相比效价提高20倍以上，能更有效地针对gp41发挥阻断膜融合的作用，已于2005年由CFDA批准进入临床试验，现已完成二期临床，经验证具有低耐药性和低毒副作用的特点。上述膜融合抑制肽是新一代的HIV病毒膜融合抑制剂，由T20改良而来，研究表明能有效发挥对gp41的结合以及HIV膜融合阻断功能。类似的多肽还有很多，目前临床上主要以注射的形式用药，但这种用药方式难以将这种膜融合抑制肽绑定在HIV的主要攻击对象CD4T淋巴细胞表面。而只有使膜融合抑制肽在细胞膜表面高度聚集才能实现抑制HIV入侵的功能。且上述蛋白药必须定期注射，使用方便性欠佳。随着科学的发展，随后又有科学家将膜融合抑制肽的基因包装到慢病毒载体中，随机整合到人基因组上，以解决前述问题。但是随机整合具有不确定性，可能会整合到重大疾病或者癌症相关基因上，安全风险比较高。近几年基因编辑技术获得突破性的发展，利用现在的编辑手段可以精准的对目的基因进行编辑。目前发展相对成熟的基因编辑技术有ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)-Cas9。其中，CRISPR-Cas9被称为第三代基因编辑技术，相比ZFN和TALEN，其构建简单，突变效率高使用成本低。CRISPR系统均包含以下几个部分(如图1所示)：1)PAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如，spCAS9/NGG；saCAS9/NNGRRT),根据此位点来选取靶序列；2)靶序列(sgRNA)，与切割位点识别并结合的序列，一般在20nt左右；3)tracRNA，靶序列之后的一段回文RNA序列；4)Cas9内切酶，具有独立核酸酶活性，Cas9含有2个独特的活性位点，分别为氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH。Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链。其工作原理为：sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于sgRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使sgRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。在使用基因敲除技术引入目的基因双链断裂的基础上，结合同源重组技术，在被敲除的基因内部插入外源DNA片段，可达到目的基因敲除和外源基因敲入的双重效果。CCR5属于G蛋白偶联因子超家族的一员，具有7个跨膜结构域，其基因位于人类3号染色体短臂，全长约6000bp，有4个外显子，蛋白长度为352的氨基酸。CCR5是HIV-1感染CD4T细胞的辅助受体之一(R5嗜性病毒通过CCR5辅助受体，X4嗜性病毒通过CXCR4辅助受体，HIV-1感染机理如图2所示)。利用小分子化合物拮抗剂或者抗体来阻断CCR5蛋白，能够有效的控制R5嗜性HIV-1对T细胞的侵染。研究表明，利用基因敲除技术(ZFN，CRISPR，TALEN)，对CCR5基因定点敲除，也能使CD4T细胞有效的抵御R5嗜性HIV-1的侵染。同时，CCR5还是一个安全港基因(safeharborgene)。将外源基因整合到CCR5基因位点不会对细胞产生毒副作用，同时该外源基因能够长时稳定的高表达。本专利技术中，将基因编辑技术和同源重组技术有机结合，在敲除CCR5基因的同时，在CCR5这个安全港基因中插入一个HIV病毒膜融合抑制肽的编码DNA序列，从而使该细胞稳定表达膜融合抑制肽而不表达CCR5。经过上述编辑改造的细胞不仅能抵御R5噬性HIV病毒的侵染，同时也能抵御X4噬性HIV病毒的侵染，达到对HIV-1病毒双重抵抗的目的。为达到上述技术效果，本方案克服了如下技术困难：(1)筛选对CCR5敲除效率较高的gRNA，以此作为膜融合抑制肽编码DNA序列插入的位点；(2)优化了同源重组工具中重组片段的大小。现有相似技术：(1)采用基因编辑技术(TALEN、ZFN或CRISPR-Cas9)敲除CCR5，从而抵抗R5嗜性HIV病毒对细胞的攻击；(2)采用慢病毒载体包装HIV膜融合抑制肽基因，介导膜融合抑制肽基因随机插入细胞基因组，从而阻止HIV病毒和细胞膜融合，继而进入细胞。(3)将一个能下调CCR5基因表达量的shRNA，以及HIV-1融合抑制肽C46，包装到一个慢病毒中，命名为LVsh5/C46。被LVsh5/C46感染的细胞能够同时抵御R5和X4嗜性的HIV-1病毒。现有技术的缺点：(1)HIV-1感染初期，体内病毒以R5嗜性为主，而感染的后期，X4噬性病毒会逐渐替代R5噬性病毒成为体内主要的病毒类型(如图3所示)，因此在长期治疗的后期阶段，CCR5敲除细胞也易感X4嗜性HIV，而导致治疗失败。(2)采用慢病毒载体将HIV膜融合抑制肽基因随机插入细胞基因组，该方案具有较高的不确定性，被插入的基因会发生沉默，一旦插入到重大疾病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统将膜融合抑制肽基因定点整合到细胞的安全港基因，使得膜融合抑制肽表达，而细胞的安全港基因不表达。

【技术特征摘要】
2016.12.30 CN 20161125912471.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统将膜融合抑制肽基因定点整合到细胞的安全港基因，使得膜融合抑制肽表达，而细胞的安全港基因不表达。2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括敲除细胞安全港基因的工具和同源重组的工具，所述敲除细胞安全港基因的工具包括锌指核酸酶、TALE核酸酶、CRISPR系统中的至少一种，所述同源重组的工具含有细胞安全港基因同源序列以及膜融合抑制肽的基因序列。3.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述细胞安全港基因为CCR5基因，所述膜融合抑制肽包含如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:5所示的氨基酸序列、SEQIDNO:6所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗思施，祝海宝，陶米林，梁福才，黄雨亭，唐忆琳，刘方方，
申请(专利权)人：广东赤萌医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44