一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法，属于烟草及烟草制品生物学效应评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、受试物暴露、收集细胞、样品制备、标准品稀释、样品测定和MDA含量计算十大步骤。本发明专利技术综合考察胶基型嚼烟细的溶出方式、暴露途径、作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化的影响。

A method for detecting the effect of gum based chewing tobacco on lipid oxidation in cells

The invention relates to a method for detecting the influence of gum based chewing tobacco on the lipid oxidation of cells, and belongs to the technical field of biological effects evaluation of tobacco and tobacco products. The method consists of ten steps: sample pretreatment, preparation of single cell suspension, cell concentration calculation of single cell suspension, exposure of subject matter, collection of cells, sample preparation, dilution of standard products, determination of sample and calculation of MDA content. This invention comprehensively investigates the dissolving way, the exposure way and the action mode of the colloid based chewing tobacco, and establishes the sample pretreatment method of the adhesive based chewing tobacco, the effective treatment of the sample, the optimum setting of the test dose and the correct selection of the target cells, so that this method can accurately and effectively detect the lipid oxidation of the colloid type chewing tobacco to the cell. The influence.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法
本专利技术烟草及烟草制品生物学效应评价
，具体涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法。
技术介绍
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟和不含烟叶原料的新型口含烟（如胶基型嚼烟）。口含烟研发人员在产品配方设计初期将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试指标对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，无统一的标准方法。机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮自由基(reactivenitrogenspecies,RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。这种现象被称为氧化性损伤，氧化性损伤是一种广谱性损伤机制，丙二醛（MAD）是脂质氧化的一种重要效应生物标志物，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的Snus型口含烟，因此，有必要针对胶基型口含自身特点建立适合胶基型嚼烟的脂质氧化评价方法。
技术实现思路
本专利技术的目的正是针对上述技术问题，对胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响进行了综合研究，确定了胶基型嚼烟的检测剂量，以及口含烟制品前处理方法，制定了一种适用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为4mL/皿接种到细胞培养皿中，之后将细胞培养皿置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：细胞对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养皿内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基；在样品测试组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；细胞对照组和样品测试组的终体积为6mL/皿；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；步骤（6），收集细胞：每皿分别收集细胞，具体的收集方式为：去除培养基，加入PBS4mL，浸泡30s后去除PBS，加入1mL0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用口腔角质细胞培养基悬起，4℃离心，弃上清液，收集细胞；步骤（7），样品制备：将步骤（6）每皿收集得到的细胞，加入100μl细胞裂解液在冰浴环境下对细胞进行裂解，裂解后，4℃离心，取上清液；步骤（8），标准品稀释：取丙二醛的标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，得到标准品稀释液；步骤（9），样品测定：将步骤（7）每皿得到的上清液和步骤（8）不同浓度梯度的标准品稀释液分别取0.1mL置于不同的离心管中，随后向各离心管中分别加入0.2mL浓度为0.185mg/ml的硫代巴比妥酸MDA检测工作液混匀，混匀后于100℃沸水中加热15min，之后室温离心，取200μl上清，酶标仪540nm测定吸光度；步骤（10），MDA含量计算：根据标准溶液的浓度及吸光度值绘制标准曲线，然后根据标准曲线及样品测试组吸光度值、细胞对照组的吸光度值，计算样品测试组和细胞对照组的MDA含量；之后，将样品测试组的MDA含量与细胞对照组的MDA含量相比，如有显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的MDA含量之间有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟会引起细胞脂质氧化；将样品测试组的MDA含量与细胞对照组的MDA含量相比，如无显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的MDA含量之间无剂量反应关系的，则为阴性结果，该胶基型嚼烟不会引起细胞脂质氧化。进一步，优选的是，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。进一步，优选的是，步骤（1）所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤，再用0.45μm有机滤膜过滤。进一步，优选的是，步骤（4）所述的细胞培养皿为60mm细胞培养皿。进一步，优选的是，步骤（5）分组时，样品测试组的各个浓度和细胞对照组均设置3个复皿。进一步，优选的是，步骤（6）和步骤（9）所述的离心速度均为1000g，时间均为10min。进一步，优选的是，步骤（7）所述的离心速度为1600g，时间为10min。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术综合考察胶基型嚼烟的溶出方式、暴露途径、作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，且根据胶基型嚼烟作用靶细胞选取了人口腔角质细胞HOK作为胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟的细胞脂质氧化检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化的影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术所采用的口腔角质细胞培养基OKM、磷酸缓冲液均为普通的商品化产品。本专利技术除非另有说明，否则百分号代表体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm

【技术特征摘要】
1.一种用于检测胶基型嚼烟对细胞脂质氧化影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为4mL/皿接种到细胞培养皿中，之后将细胞培养皿置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：细胞对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养皿内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基；在样品测试组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；细胞对照组和样品测试组的终体积为6mL/皿；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；步骤（6），收集细胞：每皿分别收集细胞，具体的收集方式为：去除培养基，加入PBS4mL，浸泡30s后去除PBS，加入1mL0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用口腔角质细胞培养基悬起，4℃离心，弃上清液，收集细胞；步骤（7），样品制备：将步骤（6）每皿收集得到的细胞，加入100μl细胞裂解液在冰浴环境下对细胞进行裂解，裂解后，4℃离心，取上清液；步骤（8），标...

【专利技术属性】
技术研发人员：管莹，高茜，李雪梅，夭建华，米其利，朱洲海，徐玉琼，唐萍，陆舍铭，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53