一种单细胞RNA逆转录与文库构建的方法技术

本发明专利技术属于转录组分析领域，涉及到一种快速进行单细胞RNA逆转录与文库构建的方法。本发明专利技术能在5‑6小时内,由1‑2000个细胞或10pg‑20ng经提取的真核生物总RNA为起始，扩增出20‑500ng高质量全长双链cDNA，并获得符合下游分析要求的高质量cDNA文库。此发明专利技术有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性和基因组DNA的污染，表达定量分子标签可辅助基因表达量计算，同时在完整扩增RNA序列信息的同时该表达定量分子标签还可保留链来源信息。本发明专利技术可获得95％以上的逆转录与扩增建库成功率，cDNA文库可无缝衔接Illumina主流测序平台，下机数据(5M Reads)可检测到90％以上的基因表达，基因表达一致性超过90％，扩增无明显偏倚，且需要的样本投入量更少。

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞RNA逆转录与文库构建的方法
本专利技术属于转录组分析领域，涉及到一种快速的单细胞RNA逆转录与文库构建方法。
技术介绍
转录组是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间和空间的限定，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。转录组分析包括但不限于：编码基因的分析、翻译蛋白的预测、外显子内含子的剪切拼接、转录本的结构分析功能分析，mRNA二级结构，基因的差异表达等等。目前成熟可靠的转录组分析手段包括RT-qPCR分析基因表达量、芯片杂交平台分析分析某些已知基因的转录活动、或者高通量测序技术等。其中应用高通量测序技术(下一代测序技术，NGS)进行转录组测序(RNA-seq)是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。相对于传统的RT-qPCR平台或芯片杂交平台，NGS技术应用于转录组分析无需预先针对已知的序列设计探针或引物，即可在转录本水平和基因水平对整体转录活动进行检测，并且具有定量更准确，检测通量更高，检测范围更广等优点。此外，在分析转录本结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确的识别可变剪切位点以及可能的点突变，提供最全面的转录组信息。准确深入地分析转录组，有助于全面理解细胞基因表达和调控网络的作用。相同组织细胞的基因型几乎一致，但细胞亚群的表达往往不同；不同组织的细胞各自拥有独特的转录组。研究这些转录组的细微差异能够从不同的生理学功能和表型角度阐释基因调控网络。一般转录组实验通常需要成千上万甚至上百万个细胞。但早期胚胎细胞和干细胞等只能收集到微量细胞，这就要求实验中利用尽可能少的细胞，最好是在单细胞水平进行转录组分析。最新研究表明，相似细胞的基因表达具有异质性，这种异质性是由不同的衍生基因组、细胞循环和微环境等决定的。常规方法得到的是大量细胞基因表达信息的共性，难以显示彼此的异质性。对单细胞转录组的分析，不仅能研究基因表达的异质性，也能研究表达的随机性，进一步揭示与发育、疾病等相关的一系列重要信息。因此在单细胞水平进行转录组分析具有重要的科学意义也是现实的迫切需要。理论上以NGS技术进行RNA-seq能在单细胞水平上进行，并且根据不同深度的分析，最终能获得整体水平全部基因的表达信息。此方法具有如下优点：a.分辨率高，起始样品量为单个细胞；b.灵敏度高；c.数字化信号，可以直接检测单个碱基差异、基因家族中相似基因以及可变剪接造成的不同表达；d.检测范围广，不仅能检测基因，还能检测RNA拼接体；e.重现性好。此方法最重要的环节是单细胞mRNA表达分析，即通过获得研究对象mRNA(转录本，基因组转录区域)的信息，鉴定转录发生位点，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。单细胞mRNA表达分析的重要前提是单细胞中痕量的mRNA(6-10pg)或pg级别的mRNA被高效且均一的逆转录和扩增。实践中，单细胞mRNA测序从样本制备到数据处理，从单细胞的分离和处理到扩增时灵敏度和偏向性都存在很多技术问题。自2009年汤富酬等人在"mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecell".NatMethods.6(5):377–82.首次报道单细胞RNA测序技术以来，许多新颖的技术被开发出来，可以更快速、更低成本地提供更多信息。与本专利相关的重要的单细胞RNA测序技术有：Smart-SeqSmart-Seq(Switchingmechanismat5’endoftheRNAtranscript)是一项具里程碑意义的技术，在2012年由美国和瑞典的科学家共同开发。作为一种单细胞测序方案，它在转录本的序列覆盖度上有所改善。基因组的完整覆盖实现了选择性转录本异构体和SNV的检测。在这种方案中，人们裂解细胞，并将RNA与包含oligo(dT)的引物杂交。然后添加几个无模板的C核苷酸，生成第一条链。这种poly(C)垂悬只添加到全长转录本上。然后将寡核苷酸引物与poly(C)突出杂交，合成第二条链。全长cDNA经过PCR扩增，以获得纳克级的DNA。PCR产物纯化后可用于测序(图1)。优点：1.不需要知道mRNA的序列。2.使用低至50pg的起始材料。3.转录本的覆盖度改善。4.高水平的可定位序列。缺点：1.并非链特异的。2.转录本长度偏向性，对超过4Kb的序列不能高效转录。3.高丰度转录本被优先扩增。4.纯化步骤可能导致材料损失。Smart-Seq2Smart-Seq2一年后发表在《NatureMethods》(2013,10(11):1096)上，对最初的Smart-Seq方案做了一些改进。新方案使用锁核酸(LNA)、更高浓度的MgCl2以及甜菜碱。它不再需要纯化步骤，可大大提高产量。在这个方案中，人们在包含游离dNTP和带有通用5’锚定序列的oligo(dT)寡核苷酸的缓冲液中裂解单细胞。之后开展逆转录，这个反应也在cDNA的3’端添加2-5个无模板的C核苷酸。然后加入模板转换寡核苷酸(TSO)，它携带了两个核糖鸟苷和一个修饰鸟苷，在3’端产生LNA，作为最后一个碱基。在第一链反应后，利用有限的循环扩增cDNA。然后通过Tagmentation，利用扩增出的cDNA快速有效地构建测序文库。优点：1.使用低至50pg的起始材料。2.不需要知道mRNA的序列。3.不再需要纯化步骤。4.转录本的覆盖度改善。5.高水平的可定位序列。缺点：1.并非链特异。2.扩增效率不高。本领域需要更高效更特异的单细胞扩增技术。
技术实现思路
本专利技术在SMART-seq2基础上做出根本性改变，可实现高效且均一的转录本扩增的同时完成文库构建。具体技术为：单细胞(或极微量细胞)经热裂解后释放总RNA，特殊设计的逆转录接头ILMN_MM_30dT和MM_6N引物(6N即NNNNNN，其为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合)和在裂解环境中与RNA的Poly(A)尾或其他区段特异性互补配对，逆转录酶的作用下对其中mRNA进行逆转录并获得cDNA第一链。(图3)。而后以模板转换(Template-switching)技术在所获得的cDNA的3’端无模板地添加2-5个(通常为3个)C核苷酸。体系中特殊设计的模板转换寡核苷酸ILMN_KK_6N3G(3’端携带1-4个核糖鸟苷和1个LNA鸟苷，LNA鸟苷作为最后一个碱基，此模板转换寡核苷酸的5’端以疏水特性封闭基团例如NH2-C6做封闭处理)在cDNA的3’端添加一段接头序列，特殊的反应保护剂可极大增强逆转录酶的模板转换活性，并在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性引导下，进行cDNA二链生成(图4)。在第二链生成反应后，利用有限的循环以Illumina通用引物和Index引物扩增cDNA。简并碱基M和K的作用是限制接头添加的方向(图5)。在一个方面，本专利技术提供一种单细胞mRNA逆转录同时构建cDNA文库的方法，包括：1)裂解单细胞或极微量细胞获得总RNA2)使用逆转录接头或MM_6N引物在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；其中所述逆转录接头为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+poly(dT)+VN，5’端以SpacerC18修饰，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞mRNA逆转录同时构建cDNA文库的方法，包括：1)裂解单细胞或极微量细胞获得总RNA2)使用逆转录接头或MM_6N引物在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；其中所述逆转录接头为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+poly(dT)+VN，5’端以Spacer C18修饰，其中V＝A或C或G；N＝A或C或G或T；所述MM_6N引物为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+NNNNNN，其中NNNNNN为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合(SEQ ID No.1)。3)在获得的cDNA第一链的3’端不依赖模板添加2‑5个C核苷酸；4)使用步骤3)获得的cDNA为模板，使用模板转换寡核苷酸在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性下进行cDNA模板转换；所述模板转换寡核苷酸为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTKK+1‑4个核糖鸟苷+一个LNA鸟苷，并在5’端以AMO修饰；5)在第二链生成后，利用有限的循环以通用引物和Index引物进行扩增获得cDNA,其中所述通用引物为：5’NH2‑C6‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM(SEQ ID No.2)所述Index引物为：5’NH2‑C6‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT...

【技术特征摘要】
1.一种单细胞mRNA逆转录同时构建cDNA文库的方法，包括：1)裂解单细胞或极微量细胞获得总RNA2)使用逆转录接头或MM_6N引物在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；其中所述逆转录接头为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+poly(dT)+VN，5’端以SpacerC18修饰，其中V＝A或C或G；N＝A或C或G或T；所述MM_6N引物为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+NNNNNN，其中NNNNNN为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合(SEQIDNo.1)。3)在获得的cDNA第一链的3’端不依赖模板添加2-5个C核苷酸；4)使用步骤3)获得的cDNA为模板，使用模板转换寡核苷酸在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性下进行cDNA模板转换；所述模板转换寡核苷酸为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTKK+1-4个核糖鸟苷+一个LNA鸟苷，并在5’端以AMO修饰；5)在第二链生成后，利用有限的循环以通用引物和Index引物进行扩增获得cDNA,其中所述通用引物为：5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM(SEQIDNo.2)所述Index引物为：5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK，其中NNNNNN为Index，N为任意碱基(SEQIDNo.3)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡春旭，陆思嘉，任军，
申请(专利权)人：上海亿康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31