【技术实现步骤摘要】
一种用于无创产前检测的文库构建方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
,尤其涉及文库构建
,特别涉及一种用于无创产前检测的文库构建方法及试剂盒。
技术介绍
目前,高通量测序技术已广泛应用到医学研究和检测领域,如无创产前检测(NIPT),有限的样本量和检测报告输出的时效性对该技术提出了更高的要求。简化文库构建流程、提高低起始量样本的建库成功率势在必行。通过优化和改进文库构建方法,缩短酶反应时间和建库步骤、提高样本转化成文库的效率成为高通量测序技术拓展应用领域的一大关键点。经典的高通量文库构建步骤包括:1.基因组打断(包括物理打断法和化学打断法,如covaris超声打断、fragmentase酶切打断);2.双链DNA(Deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸)末端修复;3.3’末端加dATP(deoxyadenosinetriphosphate,三磷酸脱氧腺苷);4.加与测序平台匹配的接头;5.PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链式反应)扩增。每个步骤都需要进行纯化反应,有时还需要在酶反应之后进行一次片段选择(步骤1、4、5其中之一),整个流程需要大概8-9个小时才能完成。为简化流程,一些生物公司推出了新的建库技术,如illumina公司提出了基于转座酶的打断与加接头一步完成的快速建库方法,但该方法存在明显的测序数据碱基偏向性问题,且无法应用到血浆游离DNA这类不需要打断的样本。此外,illumina和BiooScientific等公司提出了无需PCR(PCR-free)的方法,节省PCR扩增步骤,但对样 ...
【技术保护点】
一种用于无创产前检测的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’‑5’外切活性的聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP;在所述反应体系中,直接加入鼓泡型接头和连接反应混合液,使上一步产生的3’A突出的双链DNA与所述接头连接;纯化上一步接头连接的产物后,加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增,其中一条引物5’末端有磷酸化修饰,得到大量双链DNA,其中一条链的5’端有磷酸基团;纯化上一步PCR扩增的产物后,利用热变性将所述双链DNA变成单链脱氧核酸,并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸作为介导桥序列,与变性后的单链脱氧核酸杂交及连接反应,使目的单链核酸环化,得到所述文库。
【技术特征摘要】
2016.11.21 CN PCT/CN2016/1066091.一种用于无创产前检测的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP;在所述反应体系中,直接加入鼓泡型接头和连接反应混合液,使上一步产生的3’A突出的双链DNA与所述接头连接;纯化上一步接头连接的产物后,加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增,其中一条引物5’末端有磷酸化修饰,得到大量双链DNA,其中一条链的5’端有磷酸基团;纯化上一步PCR扩增的产物后,利用热变性将所述双链DNA变成单链脱氧核酸,并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸作为介导桥序列,与变性后的单链脱氧核酸杂交及连接反应,使目的单链核酸环化,得到所述文库。2.一种用于无创产前检测的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP;在所述反应体系中,直接加入含U的鼓泡型接头和连接反应混合液,使上一步产生的3’A突出的双链DNA与所述接头连接,同时加入USER酶,进行消化反应,使连接上所述接头的DNA的5’端经USER酶切后产生5’磷酸基团;纯化上一步接头连接的产物后,利用热变性将所述双链DNA变成单链脱氧核酸,并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸作为介导桥序列,与变性后的单链脱氧核酸杂交及连接反应,使目的单链核酸环化,得到所述文库。3.一种用于无创产前检测的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP;在所述反应体系中,直接加入Y型接头和连接反应混合液,使上一步产生的3’A突出的双链DNA与所述接头连接;纯化上一步接头连接的产物后,加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增,其中一条引物5’末端有磷酸化修饰,得到大量双链DNA,其中一条链的5’端有磷酸基团;纯化上一步PCR扩增的产物后,得到可以用于上机测序的文库。4.一种用于无创产前检测的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基...
【专利技术属性】
技术研发人员:张艳艳,江媛,李巧玲,魏汉敏,赵霞,董超,沈寒婕,田凯,于竞,傅书锦,苏小珊,耿春雨,
申请(专利权)人:深圳华大基因科技有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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