一种用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于FISH探针标记的BAC‑DNA的快速制备方法，包括(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行DNA打断；(3)采用离心柱法回收纯化DNA。本发明专利技术采用超声波破碎取代了限制性内切酶的酶切步骤，省略了酶切前DNA纯化步骤，利用超声波直接将细菌澄清裂解液中超螺旋的BAC‑DNA打碎成10kb以下的双链线性DNA，再使用硅基膜柱离心法进行纯化回收，避免了传统制备工艺中多次的纯化操作造成的DNA损失，大幅减少了制备时间和成本，提高了成品DNA得率5倍以上。

【技术实现步骤摘要】
一种用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法
本专利技术涉及分子生物学体外诊断试剂，具体涉及一种用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法。
技术介绍
FISH是利用荧光素标记的DNA探针来检测在细胞、组织和肿瘤的特定DNA序列的分子生物学检测技术。首先，样本DNA变性，加入特定的荧光素标记的探针与变性的样本混合进行杂交，退火得到双链DNA。探针信号能够被荧光显微镜捕获，从而定性、定量地检测目标DNA。FISH用途广泛，如应用于非整倍体，微缺失综合征以及基因重排的检测。而这些对很多遗传性疾病，如白血病、淋巴瘤、实体瘤、自闭症等发育综合征有重要的临床意义。因此，FISH是来检测或确认基因或染色体异常的分子检测技术，通常用于遗传咨询、医学和品种鉴定、DNA特定功能研究。目前比较常见的FISH探针多采用BAC-DNA，采用切口平移的方法进行探针标记。细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)是指一种以F质粒(F-plasmid)为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb-300kb左右大小的DNA片段，属于低拷贝严谨型质粒。由于BAC分子量巨大，给提取纯化带来了诸多困难。目前比较常用的BAC提取试剂盒多采用异丙醇对裂解液中的DNA进行沉淀，此方法虽然有效的回收了BAC-DNA，但异丙醇同时沉淀了裂解液中的RNA和残留的蛋白，纯度难以达到要求，需要进一步使用RNase除去RNA；用酚氯仿或离子交换柱去除蛋白质，此过程不仅繁琐费时，更会造成DNA的损失。柱离心纯化法是目前最常用的一种核酸纯化方式，具有操作简单、回收率高、性能稳定的特点，其中使用的核酸纯化柱采用硅基质膜为滤芯，在低PH高盐环境下特异性的与核酸结合，在高PH低盐环境下释放结合的核酸，可以仅通过简单的离心操作，快速高效的纯化DNA。虽然此方法快速简便，但市售常见的硅基膜离心柱仅能对100bp-10kb的DNA片段进行有效的回收，10kb以上的DNA片段时回收率明显降低，对30-50kb以上的片段几乎无法回收，而BAC-DNA的长度最小为150kb，无法利用此方法有效回收。切口平移法(nicktranslation)法是实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。以限量的DNaseI在待标记的双链DNA的每一条链上产生若干个单链缺口；再利用E.coliDNA多聚酶Ⅰ的5’-3’外切酶活性和5’-3’多聚酶活性，在缺口处的5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口，随着缺口在DNA链上的移动，标记的核苷酸就掺入到新合成的DNA链中。虽然线状、超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为缺口平移法的模板，但实际应用中为避免超螺旋结构对酶不敏感，多采用EcorI酶对BAC-DNA进行单酶酶切，将长的超螺旋BAC-DNA处理成为小片段的双链线性DNA后再进行标记。限制性内切酶需要在特定的条件下才能进行酶切,需要将DNA进行初步纯化加入到酶切体系中,酶切过程中BAC-DNA被稀释，同时加入了酶蛋白、盐等杂质，所以酶切后需要使用DNA纯化试剂盒对DNA进行再次纯化和浓缩，又会进一步造成DNA的损失。如图1所示，传统的BAC-DNA制备流程包括下列步骤：1)菌液裂解获得裂解液；2)酶切前BAC-DNA纯化；3)BAC-DNA酶切；4)酶切产物DNA再次纯化。整个过程操作复杂繁琐，且经过两次回收纯化，DNA损失巨大。一般500ml菌液澄清裂解液中双链DNA含量约500-600ug，酶切前纯化使用阴离子交换柱纯化DNA(QIAGENLarge-ConstructKit)回收率为约10％(不去除基因组DNA)和4％(去除基因组DNA)左右,硅基膜离心柱纯化DNA(QIAGENPlasmidPlusKit)回收率在5％左右；酶切处理后再次使用硅基膜离心住纯化(QIAquickPCRPurificationKit)回收率在40-60％,成品DNA产量为10-30ug，回收率最高在5％左右，且需要使用大量RNase、离子交换柱、内切酶等耗材试剂，费用昂贵，操作复杂，整个制备过程需要2-3天。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成本低、方便快速的用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法，包括以下步骤：(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行DNA打断；(3)采用离心柱法回收纯化DNA。所述步骤(2)将双链闭合超螺旋环状的BAC-DNA打断成为短的双链DNA。所述步骤(2)中，BAC-DNA经超声波打断后，所得片段大小在10kb以下。所述步骤(2)中，使用sonicsVCX130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后提取DNA。所述步骤(1)获得的澄清裂解液再经过细菌基因组去除和BAC-DNA纯化。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用超声波破碎取代了限制性内切酶的酶切步骤，省略了酶切前DNA纯化步骤，利用超声波直接将细菌澄清裂解液中超螺旋的BAC-DNA打碎成10kb以下的双链线性DNA，再使用硅基膜柱离心法进行纯化回收，避免了传统制备工艺中多次的纯化操作造成的DNA损失，大幅减少了制备时间和成本，提高了成品DNA得率5倍以上。附图说明图1是传统方法流程图。图2是本专利技术的用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法的流程图。图3是本专利技术的超声打碎效果比较图(M为λDNAHindIIImarker，1为未超声DNA片段，2-6分别为使用sonicsVCX130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环2-6次后电泳结果)。图4是BAC-DNA酶切结果和超声破碎结果比较图(M1λDNAHindIIImarker，M2为D2000marker，1为BAC-DNA经EcoRI酶切后产物，2为使用sonicsVCX130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后提取的DNA)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：如图2所示，本专利技术用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法，包括以下步骤：(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行DNA打断；(3)采用离心柱法回收纯化DNA。所述步骤(2)将双链闭合超螺旋环状的BAC-DNA打断成为短的双链DNA。所述步骤(2)中，BAC-DNA经超声波打断后，所得片段大小在10kb以下。所述步骤(2)中，使用sonicsVCX130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后提取DNA。所述步骤(1)获得的澄清裂解液再经过细菌基因组去除和BAC-DNA纯化。实施例1：快速制备BAC-DNA1、500mLLB培养基中加入适量抗生素，接入500ul工作库菌液，气浴摇床37℃，200rpm培养16小时。2、6000rpm离心菌液10分钟，倒掉上清，加入20mlP1buffer重悬菌体；加入20mlP2buffer，轻柔颠倒混匀4-6次，室温放置不超过5分钟；加入20mlP3buffer，轻柔颠倒混匀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于FISH探针标记的BAC‑DNA的快速制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行DNA打断；(3)采用离心柱法回收纯化DNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行DNA打断；(3)采用离心柱法回收纯化DNA。2.根据权利要求1所述用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法，其特征在于，所述步骤(2)将双链闭合超螺旋环状的BAC-DNA打断成为短的双链DNA。3.根据权利要求2所述用于FISH探针标记的BAC-DNA的快速制备方法，其特征在于，所述步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜宏伟，缪为民，石琳，崔丽娟，邱艳，
申请(专利权)人：协和干细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12