本发明专利技术涉及在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，其中使用了含有重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，其中使用了含有重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基。 本专利技术还涉及含有重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基用于培养细胞浓度小于100个细胞/ml的细胞群的用途。本专利技术还涉及在含重组白蛋白和重组转铁蛋白的无血清细胞培养基中培养的细胞浓度小于100个细胞/ml的细胞群。常规的细胞培养基通常补充有不确定的添加剂，例如胎牛血清(FBQ。这种添加物为载体提供了不稳定或水不溶性成分，提供了生长因子并保护细胞免受物理应力。另一方面，使用血清具有一些缺点。血清是未表征的物质的混合物，其可能随批次变化。然而，来自动物或人来源的血清或其它补充物的主要缺点是外源因子污染的风险，例如支原体、朊病毒和病毒污染。为了克服与血清有关的病原性污染的风险，过去已经开发了无血清培养基。无血清培养基通常补充有血清替代物，例如生长因子、细胞因子、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白。这些蛋白通常分离自动物来源，因此培养基受病原体污染的潜在风险依然存在。例如，利用分离自动物或人来源的牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或转铁蛋白可便于细胞培养(US6733746)。这种方法仍然存在向细胞培养物中引入外来病原体，例如来自HSA的 HIV、克雅氏病因子(Creutzfeld Jakob agent)或肝炎病毒的风险。病原体不利于培养基在动物和人治疗剂的生产中的应用。已经描述了仅含有重组产生的蛋白质并因此降低了病原性污染的风险的培养基。已经公开了包含重组白蛋白和另外的源自动物的成分的培养基 (W02008009642)和含有重组白蛋白和重组胰岛素的培养基(US20060115901)。通常向无血清培养基中加入的常规添加剂是转铁蛋白。转铁蛋白通常分离自动物或人来源，并且加入至无血清培养基中以为细胞提供铁。Qian, Z.M. ^P Tang, P. L.，1995， Biochim. Biophys. Acta, 1269 :205-214已经综述了哺乳动物细胞摄取铁的机制。进一步的出版物表明转铁蛋白可能是支持细胞增殖的生长因子。另一方面，已经表明转铁蛋白受体缺陷型细胞可以以与野生型细胞相当的速率增殖，这表明该受体不属于生长因子受体家族(Chan, R.等，1992，Experimental cell research 202:326-336)。在缺乏转铁蛋白受体的情况下，细胞可以通过非特异性受体非依赖机制摄取铁。通常，细胞可以摄取铁的机制有三种1.从转铁蛋白经由受体依赖性途径，2.从转铁蛋白经由受体非依赖性途径(非特异性)，3·从无机铁盐，例如 FeSO4(Chan，R.等，1992，Experimental cell research 202 326-336)。后一铁摄取途径是向培养基中加入许多无机铁螯合剂的基础，其向细胞提供铁并忽略转铁蛋白的其它作用(EP1210410)。由于细胞从无机铁盐的非特异性铁摄取，已经开发了许多完全不含任何蛋白质的细胞培养基。有趣的是，细胞在不含蛋白的培养基中生长得非常好，从而使目前本领域的培养基不含任何蛋白质。总之，已公开的数据证明转铁蛋白能够在哺乳动物细胞中介导铁的摄取。然而，由于细胞还可以从无机铁螯合剂摄取铁，因此补充铁并不一定需要转铁蛋白。截至目前，还不清楚转铁蛋白除了其作为铁提供者的作用外是否还对细胞具有生长因子样作用。在利用动物细胞培养物生产治疗性蛋白的过程中，证明生产细胞系的克隆性很重要。这表示，在遗传上经过修饰的生产细胞系应起源自单个前体细胞，所述前体细胞是通过在培养皿中每个孔仅接种一个细胞而克隆的单个细胞。使单细胞状态的细胞暴露于快速变化的环境条件，如PH变化、温度变化或聚集的氧化介质产物的有害作用。相比之下，细胞群中共培养的细胞从其相邻细胞接受诸如细胞因子的支持增殖和存活的成分。当在单细胞培养过程中省略该支持时，许多克隆不能应付提高的培养应力。当将单克隆接种至培养皿，例如96孔板中时，克隆不能从周围接受刺激性支持。这常常导致细胞死亡或非增殖行为。为了避免这些难题，通常在培养基中存在胎牛血清(FBQ的条件下进行单细胞克隆。因此，由于血清的上述缺点，开发不含血清的单细胞克隆培养基意义重大。已经开发了在不含血清的培养基中以非常低的细胞密度培养CHO细胞的方法。除此之外，所述培养基包含重组白蛋白和重组胰岛素(US20060115901)。通常向不含血清的单细胞克隆培养基中加入条件培养基。条件培养基包含由同一细胞群产生的细胞因子并因此应促进单细胞的克隆生长(W02005014799)。然而，条件培养基中细胞因子的浓度低并且条件培养基还包含抑制生长的细胞毒性代谢物，从而使这种培养基的促生长作用受到限制。另一种方法是实际生产克隆和母细胞的共培养。为了除去所谓的饲养细胞的生长能力，可以使该细胞接受辐射。不生长的饲养细胞将释放刺激生长克隆分裂的生长因子 (EP1176194，US2005/0059146)。利用饲养细胞培养的缺点是难以从饲养细胞分离生产克隆。必须证明饲养细胞没有附着至生产克隆。总之，公开的数据证明，需要用于在无血清培养基中进行细胞的单细胞克隆的简单的新方法。本专利技术的技术问题是提供克服现有技术的缺点的方法和细胞培养基。本专利技术的进一步技术问题是提供尤其在无血清培养基中进行细胞的单细胞克隆的更简单的方法。本专利技术的进一步技术问题是提供在培养基中(尤其在无血清培养基中)以低细胞浓度进行细胞群培养的更简单的方法。本专利技术通过提供独立权利要求的教导而解决了上述问题。具体地，本专利技术提供了一种在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，所述方法包括如下步骤a)在第一无血清细胞培养基中以大于约100个细胞/ml，尤其大于100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞群，b)降低所述细胞浓度至小于约100个细胞/ml，尤其小于100个细胞/ml，和c)在第二无血清细胞培养基中培养所述细胞，其中所述第二无血清细胞培养基包含重组白蛋白和重组转铁蛋白。具体地，本专利技术提供了一种在无血清细胞培养基中培养细胞群的方法，其中所述细胞群的细胞浓度小于100个细胞/ml，所述方法包括如下步骤a)在第一无血清细胞培养基中以大于约100个细胞/ml，尤其大于100个细胞/ml的细胞浓度培养细胞群，b)降低细胞浓度至小于约100个细胞/ml，尤其小于100个细胞/ml，和c)使所述细胞接触第二无血清细胞培养基，其中所述第二无血清细胞培养基包含重组白蛋白和重组转铁蛋白。在本专利技术的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于200个细胞。在本专利技术的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约200个细胞。在本专利技术的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于500个细胞。在本专利技术的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于约1000个细胞。在本专利技术的优选的实施方式中，步骤a)中的细胞浓度大于 1000个细胞。在本专利技术的优选的实施方式中，在步骤b)中将所述细胞浓度降低至小于50个细胞/ml。在本专利技术的优选的实施方式中，在步骤b)中将所述细胞浓度降低至小于10个细胞/ml。在本专利技术的优选的实施方式中，在步本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：科利亚·黑格勒，奥拉夫·克吕格尔，阿齐兹·恰伊勒，
申请(专利权)人：塞尔卡有限公司，
类型：发明
国别省市：
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