MDCK克隆细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了MDCK克隆细胞株及其应用，属于MDCK克隆细胞株领域。本发明专利技术采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，进一步亚克隆，最终获得2株性能优异的单克隆细胞株；这两株单克隆细胞株的生长速度较母本细胞快，能够很好繁殖禽流感病毒，显著提高病毒在细胞中的复制水平，获得较高效价的病毒液，相比母本细胞培养的病毒HA效价滴度有显著提升。两株细胞株的微生物保藏编号分别为：CGMCC No.10008和CGMCC No.10009。本发明专利技术提供的MDCK克隆细胞株能够高效培养病毒，显著提高病毒滴度，在流感病毒的疫苗生产中应用价值高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及克隆细胞株，尤其涉及MDCK克隆细胞株，本专利技术还涉及所述MDCK克隆细胞株在培养禽流感病毒中的应用，属于MDCK克隆细胞株的克隆和应用领域。
技术介绍
过去中国一直通过鸡胚生产禽流感疫苗，需要消耗大量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制。这种生产方法效率低，不利于应对大规模的流感爆发。禽流感在中国不同地区流行情况不同，并且禽流感在不同地区之间的扩散快；用鸡胚生产禽流感疫苗，必须提前做出精确计划，但一般来说禽流感多呈爆发流行，难以在短时间内购置生产疫苗所需的数百万只鸡蛋。为此，世界卫生组织鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。以哺乳动物细胞为基质制备疫苗无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。Tina Lombardo等人通过多种细胞培养禽流感病毒，通过比较发现，狗肾来源的MDCK细胞系是禽流感病毒最易感的细胞，具有下列优势：(1)容易扩大；(2)容易收集细胞。但是，目前MDCK细胞培养流感病毒的病毒滴度与用鸡胚培养方法相比，仍然较低，制约了其在制备禽流感疫苗中的应用。亟需要从MDCK母本细胞株中筛选获取能够有效提升禽流感病毒滴度的MDCK克隆细胞株。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是从MDCK母本细胞株中克隆得到能够有效增殖禽流感病毒且显著提高病毒滴度的MDCK克隆细胞株。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术选择种细胞MDCK，采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，然后选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，最终获得5株单克隆细胞，分别命名为MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2。本专利技术对5株单克隆细胞MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2的形态、胰酶敏感性和生长特性进行了研究并对禽流感病毒的适应性进行了分析。实验结果显示，MDCK-1F7和MDCK-2D6两株克隆细胞的性能最优异。与母本细胞相比，单克隆细胞株MDCK-1F7和MDCK-2D6生长速度显著加快；对0.25％胰酶敏感，同母本细胞相比消化效率成倍提高；应用MDCK-1F7和MDCK-2D6接种禽流感病毒H5N1RE-6株，能够很好繁殖重组禽流感病毒H5N1RE-6株，显著提高了该病毒在细胞中的复制水平，并且获得较高效价的禽流感病毒液，其血凝效价HA不低于28，与母本MDCK细胞培养的病毒的HA效价27相比，提高了一个滴度。本专利技术将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10008；分类命名是：MDCK克隆细胞株；保藏时间是：2014年11月25日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-2D6提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10009；分类命名是：MDCK克隆细胞株；保藏时间是：2014年11月25日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术所述MDCK克隆细胞株MDCK-1F7和MDCK-2D6能够应用于培养病毒，尤其在禽流感疫苗的生产中应用潜力大。其中，所述病毒包括流感病毒(Influenza virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)或人类副流感病毒(Human Parainfluenza Viruses)。优选的，所述流感病毒(Influenza virus)包括：禽流感病毒(Avain Influenza Virus)、人流感病毒(Human Influenza Viruses)或马流感病毒(Equine Influenza virus)；最优选为禽流感病毒。本专利技术进一步公开了所述MDCK克隆细胞株MDCK-1F7或MDCK-2D6在培养病毒中的应用，包括以下步骤：(1)培养所述MDCK克隆细胞株株MDCK-1F7或MDCK-2D6；(2)接种病毒，吸附，加入维持液，继续培养；(3)收获病毒液，即得。其中，步骤(1)所述培养优选为37℃，体积分数为5％CO2的条件下培养48-72h至形成细胞单层，优选为培养48h。步骤(2)所述接种是按照感染复数MOI＝0.01-1.0接种病毒；优选的，按照感染复数MOI＝0.1接种病毒。步骤(2)所述的吸附为37℃，体积分数为5％CO2的条件下吸附1h；所述维持液为DMEM维持液；优选的，所述维持液中含终浓度0.5-7.5μg/ml TPCK-胰酶和0.1-2.0％FBS；更优选的，所述维持液中含终浓度5μg/ml TPCK-胰酶和0.2％FBS。步骤(2)所述病毒优选为禽流感病毒，更优选为禽流感病毒H5N1RE-6株。本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术从MDCK母本细胞株中克隆得到了2株性能优异的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7和MDCK-2D6，两株细胞克隆株能够高效的繁殖禽流感病毒H5N1RE-6株，获得较高效价的禽流感病毒液，其血凝效价HA不低于28，比母本MDCK细胞培养病毒的HA效价提高了一个滴度，在禽流感疫苗的生产中有较高的应用价值。本专利技术所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。术语“单细胞克隆”意指将一个细胞进行培养，使之不断分裂，形成一个细胞群的过程，这一群细胞来源于一个共同的祖先细胞。术语“亚克隆”意指在细胞克隆中，对培养的细胞，从原有的克隆中再筛选出具有某种特性的细胞进行培养。术语“传代”意指当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液的过程，否则将影响细胞的继续生存。附图说明图1为MDCK克隆细胞株的细胞形态；其中，A：MDCK-1F7；B：MDCK-1E3；C：MDCK-2F6；D：MDCK-2D6；E：MDCK-3E2；F：MDCK；图2为MDCK克隆细胞株的生长曲线测定结果。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株MDCK克隆细胞株MDCK‑1F7，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.10008。

【技术特征摘要】
1.一株MDCK克隆细胞株MDCK-1F7，其特征在于，其微生物保藏
编号是：CGMCC No.10008。
2.一株MDCK克隆细胞株MDCK-2D6，其特征在于，其微生物保藏
编号是：CGMCC No.10009。
3.权利要求1或2所述MDCK克隆细胞株在培养病毒中的应用。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：所述病毒包括流感病毒
(Influenza virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)或人类副流感病毒(Human 
Parainfluenza Viruses)。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，所述流感病毒(Influenza 
virus)包括：禽流感病毒(Avain Influenza Virus)、人流感病毒(Human 
Influenza Viruses)或马流感病毒(Equine Influenza virus)；优选为禽流感
病毒。
6.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂映霞，李彦伟，丁国杰，毛春玲，步帆，卢爱国，郑铁鑫，王昊，孙凯，于洪涛，李莉莉，王丹丹，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23