一种细胞富集、分离、提取的方法和仪器及单细胞分析方法技术

本发明专利技术公开了一种用阳性磁珠法，富集，提取靶细胞，分离单个细胞，并对单个细胞进行免疫和分子生物学鉴定和分析的方法和自动化仪器装置。这种方法和仪器装置,通过多种方法控制捕获磁铁和释放磁铁的开／关，完成单次或多次对靶细胞的搜索捕获，洗净和释放操作，从而达到提高靶细胞检测的灵敏度和检测的稳定性。捕获磁铁的搜索捕获靶细胞，其搜索线路可以是圆形，方形，梳形，S形或U形。此外，通过对捕获物的过滤处理，清除绝大部分游离的微磁珠，进一步提高产物的纯度，作为好的试验材料。使用特殊的过滤器和捕获磁铁的吸附相结合，可以有效清除95％以上的游离微磁珠。同时介绍用荧光免疫染色法和分子生物学方法来鉴定单个细胞的类型，分析其生物学特性，为癌症的临床诊断和治疗提供有效的生物学指标。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞的分离和分析领域，特别涉及一种细胞富集、分离、提取的方法以及细胞富集、分离、提取的装置和单细胞分析方法。
技术介绍
细胞学的研究，为人类许多疾病的原理解析，临床的诊断和处理提供了有效的方法和手段。某些疾病可以或必须要对一些病变的细胞(或靶细胞)进行鉴别，分析，以作为临床诊断,病患跟踪和患者预后的特定指标。血液循环癌细胞(Circulating tumor cells)就是一例。有关血液循环癌细胞，是由托马斯 阿什沃思(Thomas Ashworth) [I] 一个多世纪前最先报道的。然而，在相当长的一段时间内，人们对血液循环癌细胞的研究很少，对其认识和理解的程度也相当有限。究其原因，其中之一主要是因为检测和抽取血液循环癌细胞的技术不成熟，因为血液循环癌细胞是以极少量的数量存在于血液之中，一般的血液检测方法基本上达不到检测血液中的癌细胞的灵敏度。近年来，新技术的应用已经证明，检测血液循环癌细胞是可以帮助医生对病患进行诊断，跟踪和预后的，同时也可以及时评估病患对临床治疗处理的效果，特别是对于癌症已经扩散的病人。血液中癌细胞的数量跟病患的总的生存率密切相关。一些临床研究表明，某些类型的癌症，如转移性乳腺癌，大肠癌，前列腺癌等，血液中癌细胞的数量越多，通常病人的死亡率也越高。因此，研究和解明血液循环癌细胞的特点和寻找相应的临床处理措施，对防止癌症的扩散和复发，有着非常重要的意义，因为血液循环癌细胞就是癌症扩散的重要途径之一，也是肿瘤干细胞(被认为与癌症复发密切相关)存在的主要形式之一。近年来，各种新的技术方法应用到细胞特别是血液循环癌细胞的检测上，以增加对这些稀有细胞的理解，从中，相信对防止癌症的扩散和复发会有突破性发现。因此，高灵敏度的细胞分离，提取方法和检测仪器的研究，开发，对生命科学，健康相关的研究和有效的医疗处理等，有时是必须的。经过富集，抽提和纯化了的靶细胞(癌细胞即为一例)，是研究分析的好材料。如在单细胞水平上分析DNA突变和RNA/蛋白质表达变化，以帮助了解某些肿瘤的形成机制和转移过程，检测或跟踪各种病患，进行病理分析，确定各个病人的特异性，以及帮助细胞定性，分类等。在药物研究开发上，也有着重要的意义。比喩，在解明被药物杀死的癌细胞和有作用但未有杀死的细胞，以及完全没有作用的细胞个体之间的差别上，单细胞水平的研究(例获取单个的特定细胞并加以分析)，就具有特别重要的意义。为检测稀有的细胞，通常需要先富集，后抽提。最常用的方法之ー是免疫磁珠富集法。该方法是使用有特异性抗体结合的磁珠去和有特异性表面抗原的靶细胞相结合，再用磁场来吸附，抽取靶细胞。所用样品包括血液，肿瘤组织活检，或骨髓等样本。将有抗体结合的磁珠和样品混合培养后，用磁铁吸附这些靶细胞-抗体-磁珠的复合体，经过洗浄，然后释放靶细胞到目的容器里，获得高纯化的靶细胞，作为进一歩生物研究分析的材料。目前，临床上检测血液循环癌细胞的医疗仪器有强生公司的细胞研究系统。细胞研究系统是用来专门检测血液循环癌细胞的半自动化检测仪器。最近的研究表明，血液循环癌细胞是广泛存在于各种癌症病患的血液中的，并具有重要的临床价值。但由于缺乏高灵敏度的检测仪器和对检测到的血液循环癌细胞的认识有限，血液循环癌细胞的检测还没有被列入临床常规检测项目(美国临床肿瘤学会(ASCO)指南)。新的专利技术和正在研发的技术和产品也不少。新的专利专利技术有，Giaever等美国专利3970518，题为“生物粒子的磁分离”;Liberti等，美国专利5200084，题为“磁分离设备和測量方法” ;BienhauS等，美国专利5837144，题为“磁分离液成分的方法”；戴维斯等，美国专利8071395，题为“细胞磁分离方法和装置”等。新研发的产品有，AutoMACS (美天旎生物技术),Ariol (微分析系统),RoboSep (干细胞),MagSweeper[3]等。使用这些技术产品,可以不同程度地富集和检测EPCAM或角蛋白阳性细胞。然而，许多技术问题仍然需要解決。比喻说，用阳性磁珠富集法抽取的细胞产物中存在有大量的未与靶细胞结合的游离磁珠，这个问题，普遍存在于目前已知的阳性磁珠 富集方法。这些未结合的磁珠，不仅妨碍靶细胞的清楚观察，同时也影响单个靶细胞的收集，DNA/RNA的抽提效率，降低靶细胞一系列的分析数据的质量，并且，靶细胞越少，游离磁珠的影响相对越大。可以想象的另ー个问题是，既然检测的灵敏度不足成为常规检测项目的障碍，那么，如何提高检测的灵敏度和拥有好的重复性，就是ー极待解决的问题。普通的阳性磁珠富集法，离不开磁珠和磁铁的吸附效应。磁铁的大小规格，磁场强度，磁珠的大小选择都是很重要的。为了有效地捕获和收取靶细胞，需要在捕获磁铁上按上套子，这样，磁铁捕获靶细胞时，靶细胞是被吸附在套子的表面，而把靶细胞捕获到。当把磁铁从套子中抽去吋，靶细胞可以从套子上释放下来，这样可以达到有效收集靶细胞，又不损伤靶细胞的目的。可想而知，这种情况下的捕获磁铁的磁场强弱，套子的厚薄以及磁珠的大小都将影响到靶细胞的捕获效率。作出上述努力后，样品中的靶细胞也不是一次捜索捕获就可以全部抓获到的。ー些方法，试图在不更换磁铁套子又不释放被捕的靶细胞产物的情况下，从相同样品中，重复搜索捕获样品中的靶细胞，以提高靶细胞的检测灵敏度，其效果非常有限。原因是，一般的园柱形永久磁铁，磁场最強处是很集中的，靶细胞和游离的磁珠将首先占住此处，如果不预先腾出空间，将妨碍新的靶细胞的有效吸附，所以简单的重复搜索捕获，收获甚微，有时会压破已捕获的靶细胞，效果适得其反。如果每次都更换磁铁的套子，重复整个捕获，洗净和释放的全过程，所花的时间太长，加上又有释放效率的问题，不适合实际应用。显而易见，这是提高检测靶细胞灵敏度所需解决的问题。—种靶细胞，用ー种(或多种)抗体结合的磁珠富集，收集后，还需要作进ー步的细胞定性鉴定，以确定收集到的细胞是否为靶细胞以及获得靶细胞的纯度等指标。鉴定靶细胞，有不同的方法。如血液循环癌细胞的鉴定，目前多是用免疫荧光染色法，所用的荧光光谱的选择空间有限，由此限制了鉴定靶细胞特性的空间。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决上述问题而提供了一种细胞富集、分离、提取的方法以及细胞富集、分离、提取的仪器装置和ー种单细胞分析方法。本专利技术所采用的技术方案是一种细胞富集、分离、提取的方法，包括以下步骤(I)将有特异性抗体结合的微磁珠(不同大小)和要检测靶细胞(或生物标记物)的生物样品相混合培养，使微磁珠上的抗体和靶细胞(或生物标记物)相结合；(2)用ー种非磁性材料的套子套在捕获磁铁上，避免磁珠，靶细胞或其他生物标记物被捕获磁铁的磁场吸附时，直接接触到磁铁上，当捕获磁铁磁场进入开启状态是，磁珠，靶细胞或生物标记物可以被吸附在磁铁套的表面，当捕获磁铁的磁场被转换成关闭状态时，吸附在磁铁套表面的产物(磁珠，靶细胞或生物标记物)可以被释放下来；(3)当释放磁铁处于开启，捕获磁铁磁场处于关闭或减微弱时，捕获磁铁套上的吸附物(磁珠，靶细胞或生物标记物)可以被释放下来。 进ー步地，操作过程包括靶细胞的捜索捕获，洗浄，释放步骤，通过这基本的步骤，以不同的组合操作，达到提高检测灵敏度，检测的稳定性，和捕获产物的高纯度的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞富集、分离、提取的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将有特异性抗体结合的微磁珠(不同大小)和要检测靶细胞(或生物标记物)的生物样品相混合，使微磁珠上的抗体和靶细胞(或生物标记物)相结合； (2)用ー种非磁性材料的套子套在捕获磁铁上，避免磁珠，靶细胞或其他生物标记物被捕获磁铁的磁场吸附时，直接接触到磁铁上，当捕获磁铁磁场进入开启状态是，磁珠，靶细胞或生物标记物可以被吸附在磁铁套表面，当捕获磁铁的磁场被转换成关闭状态时，吸附在磁铁套表面的产物(磁珠，靶细胞或生物标记物)可以被释放下来； (3)当释放磁铁处于开启，捕获磁铁磁场出入关闭或减微弱时，捕获磁铁套上的吸附物(磁珠，靶细胞或生物标记物)可以更有效地被释放下来。2.根据权利要求I所述的细胞富集、分离、提取方法，其特征在于，操作过程包括靶细胞的搜索捕获，洗浄，释放步骤，通过这基本的步骤，以不同的组合，一次或多次的操作，达到提闻检测灵敏度，检测的稳定性，和摘获广物的闻纯度。3.根据权利要求I所述的细胞富集、分离、提取方法，其特征在干，靶细胞包括不同组织的癌细胞和血液循环癌细胞，不同体液的癌细胞和病原菌细胞等，可以通过特异性抗体富聚，分离和提取的细胞，也包括生物大分子(DNA，RNA或蛋白质)等。4.根据权利要求I所述的细胞富集、分离、提取方法，其特征在于，捕获磁铁(或磁场)是指可以将有磁珠结合的靶细胞吸附起来的磁场；磁铁套是指套在捕获磁铁上的，可以让捕获磁铁捕获物吸附在套子的表面，不让捕获物直接接触磁铁的，非磁性薄物；释放磁铁(磁场)是用来让吸附在磁铁套表面的捕获释放下来的磁铁(磁场)，靶细胞是通过捕获磁铁和释放磁铁的开或关而被捕获或释放的；这种磁铁(磁场)开或关，可以由不同的方法来达至IJ，包括电动的开或关，机械性的移动，或位置的移动，或加间隔物，或通过磁场的同性相吸，异性相斥的原理，拉开距离，减弱磁场等方法。5.根据权利要求4所述的细胞富集、分离、提取方法，其特征在于，捕获磁铁在样品槽，洗净槽和释放槽中的捜索，移动，可以是多种形状(圆形，方形，直线形，U形线，S形线等)，包括上下，左右，前后的移动。6.根据权利要求I所述的细胞富集、分离、提取方法，其特征在干，磁珠是指有特异性抗体结合在其表面，可以用来识别靶细胞，以便被磁铁的磁场吸附，达到富聚，分离和提取的目的。磁珠的大小可以是4. 5微以下，也可以是按要求特定制作的大小。7.根据权利要求I所述的细胞富集、分离、提取方法，其特征在于，所述靶细胞包括癌细胞等不同癌症患者的病变细胞或要检测的细胞，病原菌，生物大分子(D N A或R N A)等生物标记物。8.根据权利要求4所述的细胞富集、分离、提取方法，其特征在干，结合在微磁球表面上的抗体，可以是能识别细胞(或生物大分子DNA / R N A或蛋白质)各种特异性结合的抗体，例如，EpCAM和MUCl可用于循环肿瘤细胞(血液循环癌细胞)的富集和检测,CD45可用于血细胞分离，CD71可用于胎儿细胞的富集和分离提取，CD44/24可用于癌症干细胞富集和分尚提取等。9.根据权利要求I所述的细胞富集、分离、提取，其特征在于，在所述方法中増加一歩，在样品或捕获物上安上过滤装置，进ー步纯化靶细胞的方法包括 (I)安放过滤装置，过滤孔大于游离的磁珠，但小于靶细胞。这ー过滤装置放在捕获磁铁和产物(样品或捕获物)之间，便于捕获磁铁从...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓亚光，张杰，田放，
申请(专利权)人：武汉格蓝丽富科技有限公司，
类型：发明
国别省市：