本发明专利技术公开了一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin融合蛋白，以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞，命名为2B4。对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行了鉴定，融合蛋白的相对分子质量为43kDa，可溶于8M尿素。杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×105，腹水的抗体效价为1×107。Westernblot结果显示，单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白，与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，其涉及ー种杂交瘤细胞，具体涉及ー种分泌抗人β -actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
技术介绍
Actin即“肌动蛋白”是ー种中等大小的蛋白质，外观呈哑铃状，由ー个高度保守的基因编码375个氨基酸组成。単体肌动蛋白的相对分子质量为43kDa，有三个结合位点，其中ー个是ATP结合位点。肌动蛋白不仅是细胞骨架的主要组成部分，而且还构成了肌细胞中具有收缩功能的组织。肌动蛋白对于细胞活动起到很大的作用，比如细胞的转移和 分裂，原生质体的流动，动物胞囊和器官的运动，细胞间信息的传递，以及细胞的形态的建V %= (sellers JR. Fifty years of contractility research post sliding nlamenthypothesis[J]. Journal of muscle research and cell motility,2004,25(6) :475-482;Winograd-Katz SE, Brunner MC, Mirlas N, Geiger B. Analysis of the signalingpathways regulating Src-dependent remodeling of the actin cytoskeleton[J].European journal of cell biology, 2011,90 (2-3) :143-156.) aActin不仅存在于细胞质中，而且越来越多的证据表明Actin在细胞核中也具有重要的作用(Primal de Lanerolle,Leonid Serebryannyy. Nuclear actin and myosins Life without filamentsLJ」· Naturecell biology,2011,13(11) 1282-1288.) 0除了线虫类精子细胞，在所有的真核细胞当中均发现有肌动蛋白存在。在生物分子演化过程中，肌动蛋白是被高度保留下来的蛋白质分子之一，从藻类细胞到人体细胞肌动蛋白只有不到20%的变化(Berepiki A, Lichius A,Read ND. Actin organization and dynamics in filamentous fungi[J]. Nature reviewmicrobiology, 2011,9 (12) :876-87.)。Actin 可以分为 6 种，β-actin 和 y -non-muscleactin广泛分布于各种组织中，其余4种具有不同肌肉组织特异性。β-actin在肌细胞中占总蛋白的10%，即使在非肌细胞中，肌动蛋白也占细胞总蛋白的1% 5%。β-actin在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白表达水平的变化时常用它来做參照物。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术人经过反复试验，利用原核重组表达技木，表达出的人β-actin蛋白主要以包涵体的形式存在,可溶于8M尿素。电洗脱纯化后的人β-actin蛋白具有很闻的纯度，Western blot实验显不该蛋白具有很强的免疫反应性。纯化后的人β-actin蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,筛选到10株分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，对其中I株性质优良的杂交瘤细胞进行生物学特性鉴定。本专利技术杂交瘤细胞的优良特性是现有技术中的杂交瘤细胞不可比拟的，对反应的物种具有广谱性，而对β-actin蛋白具有特异性，即对包括人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白均具有优良的反应特异性。本专利技术所要解决的技术问题是提供ー种分泌抗人β -actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。本专利技术提供的技术方案是ー种分泌抗人β -actin蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞，其是保藏号为CGMCC 5908的杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该杂交瘤细胞已于2012年3月13日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，其保藏号为CGMCC5908，经检测存活。该细胞是圆形的半贴壁细胞(用弯管可以将细胞从瓶壁上吹下来，收集 细胞不需要胰酶消化，如果有细胞悬浮存在也是正常)，细胞分裂倍增的时间是16-18小吋。同时，本专利技术还提供所述杂交瘤细胞的制备方法，其步骤如下(I)将人β-actin蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只50 μ g的剂量免疫6只6 8周龄BALB/c小鼠；(2)两周后进行第2次免疫，将人β-actin蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤(I)中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；(3)2周和4周后分别进行第3次和第4次免疫，免疫剂量与方法同第2次免疫；(4)融合前3d用不加佐剂的人β-actin抗原，采用皮下加强免疫，每只剂量为100 μ g ；(5)融合前Id用不加佐剂的人β-actin抗原加强免疫,姆只剂量50μ g ;(6)小鼠断尾进行尾尖采血，4°C，4000g离心5min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1，000，000的小鼠准备进行细胞融合试验；(7)选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以I : 5 I: 10混合，1500g离心5min,弃上清；(8)轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入ImL 37°C预热的PEG 1500并轻轻混匀1.5min，然后加入20mL 1640培养基；(9)800g离心5min后弃上清，细胞中加入含有20%血清的HAT-1640培养基并混匀；(10)将混匀细胞均匀铺于96孔板中，在37°C，CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养5 7d后观察融合效果并换液；(11)换液后第4d用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液，选择阳性值高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，每孔细胞数目理论值为I 2个；(12)经过3 4次亚克隆后，即获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。所述的杂交瘤细胞可用于制备抗人β-actin蛋白单克隆抗体。本专利技术具有以下有益效果本专利技术人通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin融合蛋白，以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞，命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示融合蛋白的相对分子质量为43kDa,可溶于8M尿素。杂交瘤细胞上清的抗体效价为I X IO5,腹水的抗体效价为1X107。间接ELISA结果表明，杂交瘤细胞在体外传20代或冻存3个月后，分泌的抗体效价不变。370C保存24h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白，与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。附图说明图I.人β-actin基因的PCR扩增与表达载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其是保藏号为CGMCC 5908的杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.—种权利要求I所述的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤 (1)将人β-actin蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只50Ug的剂量免疫6只6 8周龄BALB/c小鼠； (2)两周后进行第2次免疫，将人β-actin蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤(I)中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；(3)2周和4周后分别进行第3次和第4次免疫，免疫剂量与方法同第2次免疫；(4)融合前3d用不加佐剂的人β-actin抗原，采用皮下加强免疫，每只剂量为100u g ； (5)融合前Id用不加佐剂的人β-actin抗原加强免疫,姆只剂量50 μ g ； (6)小鼠断尾进行尾尖采血，4°C,4000 g离心5 min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘如石，吴俊文，邱义兰，许凤，刘胜姿，李小曼，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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