一种单细胞分子生物学鉴定法制造技术

本发明专利技术公开了一种单细胞分子生物学鉴定法，属于生物科学和药物研发领域。该方法步骤主要包括：样品的收集、单个细胞的分离富集、单个细胞cDNA的合成和扩增、分析单个细胞的属性和组织特异性。本方法可以用于鉴定单细胞的属性和组织特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物科学和药物研发领域。
技术介绍
靶细胞的分离和富集，在细胞学，分子生物学和免疫学方面有着广泛的应用，专利申请号为201110005376. 8，名称为一种从组织中分离富集靶细胞的方法，对靶细胞的分离，富集有详细的描述。报导的血液循环癌细胞的临床研究结果显示，癌症患者的血液循环癌细胞的数量可以用于癌症患者的早期检测，诊断，病患的跟踪和预后等。由于癌细胞在癌症患者的血液中以极少量存在，为了能准确检测血液中的癌细胞的存在和数量，需要对血液样品中的癌细胞进行富集，以提高其检测的灵敏度和准确性。近年来，血液循环癌细胞的分离，富集越来越受到科研，临床上的重视。以乳腺癌患者为例，血液中循环癌细胞的数量与患者的临床表现有着密切的关联。在切除肿瘤组织后的最初的一段时间内，临床上就没有多少其他指标可以用来跟踪病患的病情。而乳腺癌的特点之一就是有很高的复发率，有效跟踪病患的病情，在临床上作出及时的处理，血液循环癌细胞的检测可提供一行之有效的指标。实践证明，光有癌细胞的检测数量指标是不够的，特别是健康普查和诊断时，不仅要知道是否有癌细胞，最好是知道该癌细胞的来源和活性状况，例如，肝癌细胞，肺癌细胞等，以便医生能作出正确的诊断和临床处理。对单个细胞进行基因表达分析，可以在鉴定癌细胞的同时，对癌症的原理解析也是必不可少的。在鉴定癌细胞属性时，在相同的病患体内，可能会有不同的基因型的癌细胞。对单个细胞进行多种基因的表达分析和变异标记物的分析，就可以鉴定细胞的属性和来源。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述问题而提供了一种单细胞分子生物学鉴定法，该方法可以鉴定单细胞的属性和组织特异性。本专利技术所采用的技术方案是一种单细胞分子生物学鉴定法，包括以下步骤(1)采集样品，将样品保存在适当的缓冲液中；所述样品可以为血液、骨髓液、组织块，生物活检，细胞系细胞等；(2)用有识别细胞的抗体结合的磁珠分离富集单个细胞；(3)将分离富集到的单个细胞收集在含有RNA Inhibitor的试管内；(4)将收集起来的单细胞用细胞裂解缓冲液来裂解单细胞，直接合成单个细胞的 cDNA，同时全面扩增该单细胞的cDNA ；(5)用定量PCR来检测单个细胞相关的多种基因的表达水平包括癌细胞相关的基因，组织特异性基因等，根据表达信号的特点，确定单个细胞的属性和组织特异性。进一步地，所述步骤C3)后，如果不需要马上对单个细胞进行cDNA合成和扩增，则可将样品放在_20°C _80°C的环境下保存到使用。优选地，所述步骤(1)中样品为血液和骨髓液时，需要用EDTA或含有固定液的采血管来收集带血液的样品。进一步地，所述步骤(4)中合成cDNA，同时全面扩增cDNA的引物结构为DNA和RNA 的混合引物。优选地，所述步骤(5)中定量PCR为qRT-PCR。更优选地，所述单个细胞包括不同的单个癌细胞和血液白细胞。本专利技术具有以下优点本专利技术的方法可以分析测定从不同的组织中分离出来的单个癌细胞的相关基因的RNA表达水平，从而用以鉴定单细胞的属性包括组织特异性和基因型，达到既可以鉴定癌细胞本身，又可以获得癌细胞的组织来源等重要信息。对细胞的鉴定，准确的临床诊断以及药物研发有着非常重要的意义，同时为癌症基因组解析提供有效的纯样品配置方法。附图说明下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为本例中用阳性抗体磁珠富聚法收集到的血液循环癌细胞的免疫荧光染色显微镜图。具体实施例方式实施例1乳腺癌患者的血液循环癌细胞和骨髓癌细胞的检测和鉴定。1. 1单细胞收集(1)用EDTA探血管，采集乳腺癌患者的血液或骨髓液，与EDTA混合好后，置于4°C 直到使用。(2)用上皮细胞粘附分子抗体结合的磁珠(StemCellTechnology)富聚样品中的癌细胞。(3)收集富聚到的靶细胞(磁珠结合阳性的单个细胞)，放入到有RNase Inhibitor的PCR试管中，保存在_80°C，或直接作为单细胞RNA表达分析之用。(4)直接用上述单细胞或从-80°C中取出的单细胞样品，加入细胞裂解液(共 5uL)，在65 °C下，处理5分钟。(IX 细胞裂解液组成成分20mM Tris-HCl (pH7. 5) ； 150mM NaCl ；ImM Na2EDTA ； ImM DGTA ； 1 % Triton ；2. 5mM Sodium Pyrophoshate ； ImMBeta-glycerophosphate ； ImM Na3V04 ；lug/mL Leupet in.备可在使用前，加入 ImM PMSF)。(5)移样品到冰上。1. 2cDNA 第一链合成(6)加入 14uL的第一链cDNA合成混合液(浓度llx RT buffer ；0. 5mM dNTP mix ； cDNA Primer mix 2. 5uM ；RNasin 0.5U).(7)处理样品在42°C，2分钟。(8)力口入 IuL Superscriptase。(9)在42 °C下，处理50分钟。(10)将样品放在冰上。1. 3cDNA 第二链合成(11)加入 20uL 的第二链 cDNA 合成混合液(浓度Klenow reaction buffer IX ； DTT ImM ；dNTP mix 0. 25mM ；RNas in 0. 5U ；Ecoli RNase HO. OlU ；Klenow Exo_20U).(12)在37°C的恒温下，处理30分钟。(13)在75 °C下，处理5分钟。(14)将样品放在4°C准备cDNA的全面扩增或保存在_80°C为未来备用。1. 4cDNA的全面扩增(15)将上述cDNA样品浓缩到5uL。(16)加入IuL扩增引物混合液(TE buffer, DTT，RNasin, cDNA全面扩增引物)。(17)力口入 9uL 扩增反应液(Isothermal buffer, dNTPs, RNasein).(18)力口入 5uL 酶混合液(Isothermal buffer, DTT, BSA, RNasein, Hydridase, Bst DNA Polymerase, T4 gene 32)。(19)将样品在50°C的恒温下，处理60分钟。(20)样品可以直接用作基因定量分析或保存在_20°C下备用。1. 5定量PCR分析单个细胞的基因表达水平(21)将扩增好的样品，稀释20-50倍。取5uL全面扩增了的cDNA样品于新的PCR试管中。(22)加入7. 5uL的多种基因的PCR引物和基因识别探针，加入12. 5uL的PCR主要成分混合液。(23)用Q-PCR仪器定量分析EpCAM(上皮细胞粘附分子).Cytokeratin(细胞角蛋白)，CD45，MUCINE1等各种基因的表达水平(表1)，鉴定单个细胞的属性和组织特异性。通过以上步骤，所获结果如表-1所示，有⑶45表达的细胞为血液白细胞，有细胞角蛋白(Cytokerat in)或上皮粘附分子表达，但没有⑶45表达的为癌细胞。图1为本实施例中用阳性抗体磁珠富聚法收集到的血液循环癌细胞的免疫荧光染色显微镜图。从图中可以看出癌细胞的蛋白质表达是CD45阴性，细胞角蛋白阳性，细胞核DAPI染色阳性。表1实施例1中利用基因表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种单细胞分子生物学鉴定法，其特征在于，包括以下步骤：（１）采集样品，将样品保存在适当的缓冲液中；所述样品可以为血液、骨髓液、组织块，生物活检，细胞系细胞；（２）用有识别细胞的抗体结合的磁珠分离富集单个细胞；（３）将分离富集到的单个细胞收集在含有ＲＮＡ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ的试管内；（４）将收集起来的单细胞用细胞裂解缓冲液来裂解单细胞，直接合成单个细胞的ｃＤＮＡ，同时全面扩增该单细胞的ｃＤＮＡ；（５）用定量ＰＣＲ来检测单个细胞相关的多种基因的表达水平包括癌细胞相关的基因，组织特异性基因，根据表达信号的特点，确定单个细胞的属性和组织特异性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓亚光，邓伟平，
申请(专利权)人：武汉格蓝丽富科技有限公司，
类型：发明
国别省市：83