MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途，所述蛋白的制备方法包括如下步骤，(1)收集稳定培养的MDCK细胞的培养液；(2)对所述培养液进行微滤，收集滤出液；(3)对所述的滤出液进行超滤浓缩，得浓缩液；(4)对所述浓缩液进行分子筛凝胶层析纯化，得纯化液；(5)对所述纯化液进行再次浓缩，得所述稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白(MDCK细胞宿主残留蛋白)溶液。所述的用途包括但不限于使用所述蛋白制备抗体或试剂盒，用于评价疫苗质量。

【技术实现步骤摘要】
MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途
本专利技术属于疫苗制剂领域，具体而言，涉及一种MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途。
技术介绍
MDCK((Madin-Dabycaninekidneycells)，由Madin和Darby于1958年从美国CockerSpaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCKCellLines)被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。残留在生物制品中的宿主细胞蛋白(hostcellprotein，HCP)属于异源蛋白，既包括宿主细胞的结构蛋白液也包括宿主细胞(传代细胞)分泌的促生长因子。HCP不仅有可能诱导机体产生抗HCP抗体，引起机体产生过敏反应，还有可能有“佐剂效应”而引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果。因此控制疫苗中HCP含量是保证疫苗质量的一项重要内容。1998年，WHO制定了《使用动物细胞生产生物制品规程》，其中对传代细胞的HCP残留量提出了指导性要求，即将传代细胞HCP含量降低至可接受水平。目前，大部分疫苗只是通过控制疫苗的总蛋白含量进行间接控制。韩国学者KimHyunSu等首先报导了检测Vero细胞制备的乙型脑炎减毒活疫苗中HCP残留含量方法，日本学者KeishinSugawara等使用酶联间接双抗体夹心法检测Veto细胞生产的乙型脑炎灭活疫苗中HCP含量，田博等报导建立间接酶联免疫法，但重复性差敏感度低，王辉等报导建立了酶联双抗体夹心法检测Vero细胞残留蛋白含量。王辉等建立的酶联双抗体夹心法检测Vero细胞残留蛋白含量的方法是最接近本专利技术的技术方案。步骤主要包括：备Veto细胞蛋白抗原参考品，免疫家兔，提纯抗体作为包被抗体并以酶标记，建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线，并对各项指标进行验证。MDCK细胞作为细胞基质主要被用作流感疫苗的研制，但目前国际上尚无用MDCK制备的流感疫苗上市，更无特异性MDCK细胞宿主蛋白(HCP)的检测手段。市面上也没有出售用于检测MDCK细胞HCP残余量的试剂盒，主要原因是MDCK细胞工艺特异蛋白以及针对该蛋白的特异性抗体难以制备。本专利技术所要解决的问题在于提供检测MDCK细胞HCP的抗原标准品和抗体，同时建立起相应的检测方法，以备在疫苗生产和质控中检测MDCK细胞HCP残余量。
技术实现思路
本专利技术首先涉及一种稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白(即为MDCK细胞宿主残留蛋白)的制备方法，所述方法包括如下步骤，(1)收集稳定培养的MDCK细胞的培养液；(2)对所述培养液进行微滤，收集滤出液；(3)对所述的滤出液进行超滤浓缩，得浓缩液；(4)对所述浓缩液进行分子筛凝胶层析纯化，得纯化液；(5)对所述纯化液进行再次浓缩，得所述稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白溶液。所述的稳定培养MDCK细胞的方法包括：(1)以3×105个/cm2接种细胞至反应器中，进行培养；(2)细胞经对数生长期逐渐进入平台期后，换成不含血清的新鲜培养基，继续培养；(3)继续培养2～4天，优选为72h，此时细胞为稳定培养的MDCK细胞。所述的对培养液进行微滤的方法为：选用0.8+0.65u、0.45+0.2u的两级5英寸柱式滤芯构成微滤系统，对细胞培养液上清进行微滤，收集滤出液。所述的超滤浓缩的方法为：选择MWCO＝100KD的膜包对滤出液进行超滤浓缩，步骤为：(1)先以小于0.3MPa的透膜压力将微滤滤出液浓缩至原体积的1/10；(2)以超滤液的8～10体积的pH7.4，0.01M的PBS充分透洗，(3)将超滤液浓缩至原体积的1/60～1/80。所述的分子筛凝胶层析纯化的方法为：采用Sepharose分子筛凝胶进行层析纯化，平衡缓冲液和洗脱缓冲液均选用0.01M，pH7.4的PBS，线性流速为50cm/h，目标洗脱峰为第一洗脱峰，收集280nm波长吸收峰≥20mAU部分洗脱液。所述的再次浓缩的步骤为：将纯化液用MWCO＝100KD的超滤离心管浓缩至原体积的1/2～1/3，再次浓缩方法与所述超滤浓缩方法相同。本专利技术还涉及一种制备所述的工艺特异蛋白的检测抗体的方法，所述的方法包括如下步骤：(1)使用所述蛋白皮下注射免疫动物，所述动物优选为家兔或豚鼠；所述蛋白用量为0.3～0.4mg/kg，免疫佐剂为弗氏佐剂，佐剂用量与蛋白溶液为1：1(v/v)；(2)免疫双向扩散测定血清效价达到≥1：32后，处死动物并取全血；(3)分别选择效价较高的抗血清进行纯化，得到抗MDCK细胞蛋白IgG。所述的抗血清纯化步骤为：(1)辛酸-硫酸铵法粗提纯抗血清；(2)用市售预装Protein-A亲和层析柱进行亲和层析，收集洗脱峰≥30mAU的洗脱液部分，合并洗脱液并用MWCO＝10KD的超滤浓缩离心管浓缩洗脱液成原体积的1/10，同时更换缓冲体系为0.01M，pH7.4的PBS，得到抗MDCK细胞蛋白的IgG抗体。本专利技术还涉及以所述检测抗体制备的检测所述工艺特异蛋白的检测试剂盒，优选的，所述的试剂盒为，基于双抗夹心法原理的ELISA检测试剂盒。本专利技术还涉及由所述方法制备获得的稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白,所述蛋白的分子量范围为13KD、17KD、29KD～44.3KD、44.3KD～66.4KD以及97.2KD。本专利技术还涉及所述的检测抗体或检测试剂盒在评价疫苗质量中的应用。本专利技术还涉及所述的工艺特异蛋白工艺特异蛋白在评价疫苗质量中的应用。本专利技术提供了MDCK细胞工艺蛋白及其制备方法，并以该蛋白作为免疫原建立MDCK细胞HCP的检测方法和检测试验标准品。这种方法制备的MDCK细胞工艺蛋白应用范围更大，不仅可以用于H5N1型流感疫苗，还可以用于疫苗制备过程中的质量控制与分析，并且特异性强、灵敏度高、重复性好。附图说明图1、MDCK细胞工艺特异蛋白制备方法流程图。图2、7.5L反应器细胞培养结果。图3、MDCK细胞蛋白Sepharose4FastFlow分子筛凝胶层析色谱图。图4、MDCK细胞工艺特异蛋白标准品SDS-PAGE考染图(左)和银染图(右)。图5、两种抗体纯化后的鉴定分析(左为考染图右为westernblot图)。图6、MDCKHCP抗体检测趋势线。图7、抗体最佳检测线性范围。图8、抗体特异性验证。图9、疫苗HCP浓度的检测趋势线。具体实施方式主要材料：MDCK细胞从ATCC(美国标准菌种保藏中心)引进：MDCKCCL-34，P55，Lot：59681577；家兔和豚鼠由武汉生物制品研究所股份有限公司动物房提供；酶标板购自美国Costar公司；辣根过氧化物酶(HRP)购自阿拉丁公司。主要仪器设备：超滤器、超滤膜、超滤浓缩器购自赛多利斯公司；色谱纯化仪色谱柱、纯化介质购自GEHealthcare公司。实施例1，MDCK细胞工艺蛋白的制备方法：1、7.5L反应器培养细胞：取一支工作细胞库MDCK细胞复苏，经T瓶复苏传代放大至10L转瓶，培养到一定的细胞量，以3×105个/cm2接种细胞至反应器中，进行培养。细胞经短暂的调整很快进入对数生长期并维持到72h，从96h细胞逐渐进入平台期，细胞量维持在2×106个/c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤，(1)收集稳定培养的MDCK细胞的培养液；(2)对所述培养液进行微滤，收集滤出液；(3)对所述的滤出液进行超滤浓缩，得浓缩液；(4)对所述浓缩液进行分子筛凝胶层析纯化，得纯化液；(5)对所述纯化液进行再次浓缩，得所述稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白溶液。

【技术特征摘要】
1.一种稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤，(1)收集稳定培养的MDCK细胞的培养液；(2)对所述培养液进行微滤，收集滤出液；(3)对所述的滤出液进行超滤浓缩，得浓缩液；(4)对所述浓缩液进行分子筛凝胶层析纯化，得纯化液；(5)对所述纯化液进行再次浓缩，得所述稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的稳定培养MDCK细胞的方法包括：(1)以3×105个/cm2接种细胞至反应器中，进行培养；(2)细胞经对数生长期逐渐进入平台期后，换成不含血清的新鲜培养基，继续培养；(3)继续培养2～4天，此时细胞为稳定培养的MDCK细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的对培养液进行微滤的方法为：选用0.8+0.65u、0.45+0.2u的两级5英寸柱式滤芯构成微滤系统，对细胞培养液上清进行微滤，收集滤出液。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的超滤浓缩的方法为：选择MWCO＝100KD的膜包对滤出液进行超滤浓缩，其步骤为：1)先以小于0.3MPa的透膜压力将微滤滤出液浓缩至原体积的1/10；2)以超滤液的8～10体积的pH7.4，0.01M的PBS充分透洗，3)将超滤液浓缩至原体积的1/60～1/80。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的分子筛凝胶层析纯化的方法为：采用Sepharose分子筛凝胶进行层析纯化，平衡缓冲液和洗脱缓冲液均选用0.01M，pH7.4的PBS，线性流速为50c...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓明，黄晓媛，吕鹏，刘洋，施金荣，赵巍，韩静，张家友，韩锡鑫，邱阿明，王英，乐欣如，程健曦，鲁建忠，段凯，李新国，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42