本发明专利技术公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株及其筛选和应用。该菌株分类命名为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)DT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 14949。处理方法包括以香豆素为唯一碳源的培养基进行菌株筛选和分离及16S rDNA鉴定；同时探究该菌发酵培养液对黄曲霉毒素B1的降解作用。通过挑取固体培养基上阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)单菌落接种于50mL生长培养基中，30‑40℃的条件下摇床振荡12‑24h，将其发酵培养液与浓度为2μg/mL黄曲霉毒素B1于暗处反应3‑4d，可达到82.98％的降解率。本发明专利技术筛选的阿耶波多氏芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1有明显的降解作用，且具有高效节能、环境友好等特点，可应用于相关黄曲霉毒素脱毒剂的制备。
【技术实现步骤摘要】
降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株及其筛选和应用
本专利技术属于新菌种筛选技术及微生物
，特别涉及一株能降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株及其应用。
技术介绍
黄曲霉毒素是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，其基本结构是双呋喃环和香豆素。它主要由黄曲霉、寄生曲霉等曲霉生成的次级杂环代谢产物。黄曲霉毒素是剧毒物质，具有极强的致癌性，长期摄入毒素在肝脏蓄积可引起肝癌，并引发其他器官如肾、肺、胃肠等癌变，在所有黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，已被国际癌症研究机构(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)归为I级人类致癌物。黄曲霉毒素主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米中。据联合国粮农组织(FAO)统计，全世界每年谷物产量的25％受到霉菌毒素不同程度的污染，特别是黄曲霉毒素的污染，其中AFBl污染最为严重为玉米，其次为稻谷和小麦。世界卫生组织(WHO)规定食品中黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg，我国在食品中真菌毒素限量GB2761-2017中，对黄曲霉毒素B1分别在花生、玉米、大米、植物油、豆类、发酵食品以及乳制品中的限量制定了明确规定。降低或除去食品和饲料中的黄曲霉毒素的方法主要集中在物理和化学方式。物理方法主要有光照、超声波和超高温等，但这些过程可能会受到温度、时间等因素的影响，造成食品中营养物质的破坏和损失。化学方法是添加一些物质来降解或破坏黄曲霉毒素，如添加氧化剂，铵解法和氢氧化钠法等，但这些化学物质可能会残留在食品中并且很难去除，因此常规的物理和化学方法去除食品中的黄曲霉毒素存在效果不稳定、营养成分损失大、饲料适口性差、难以规模化生产等缺点，较难广泛用于生产实践。因此，需要来建立一种安全、高效、环保的控制黄曲霉毒素污染的方法来弥补物理和化学去毒方法存在的诸多应用缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可用于降解和去除黄曲霉毒素B1的菌株和应用方法，来克服和替代现有脱毒技术的缺点与不足，本专利技术为去除黄曲霉毒素提供一种新型简单易行、高效节能、特异性强的微生物处理方法，具有广阔的应用前景。本专利技术以香豆素为唯一碳源的培养法对降解黄曲霉毒素B1菌株进行了筛选。香豆素作为唯一碳源培养法：称取土壤样品加入到装有无菌生理盐水的三角瓶中，磁力搅拌振荡均匀制成悬液，将悬液转入离心管，并在3000-4000g下离心，取上清液用无菌生理盐水稀释，吸取适量稀释液涂布于香豆素固体培养基上，30-37℃下培养6-7d，待培养皿中长出菌落后，挑取单个菌落在香豆素固体培养基上进行反复分离划线，并连续三代培养获得遗传稳定性的菌株，即为所述降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株。作为优选，所述香豆素固体培养基组分为：香豆素1g/L、KH2PO40.25g/L、CaCl2·2H2O0.005g/L、FeCl3·6H2O0.003g/L、KNO30.5g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、(NH4)2SO40.5g/L，琼脂15-20g/L，余量为蒸馏水。本专利技术还公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的发酵培养液，其制备方法如下：将本专利技术筛选的所述菌株接种到LB液体培养基或营养肉汤培养基中，培养18-24h后，获得发酵培养液。作为优选，所述LB液体培养基的组分为：8-10g/L蛋白胨，5-8g/L酵母粉，10-15g/L氯化钠，pH6.8-7.0。作为优选，营养肉汤培养基组分为8-10g/L蛋白胨，3-5g/L牛肉膏，5-8g/L氯化钠，pH7.0-7.2。所述菌株的接种量为1-2％(V/V)。本专利技术还公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的发酵上清液，制备方法为将所述发酵培养液经9000g离心5-10min，得到发酵上清液。本专利技术还公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的菌体干粉，制备方法为将所述发酵培养液离心，沉淀经12-24h冷冻干燥获得菌体干粉。本专利技术还公开了一种所述菌株用于降解食品或饲料中黄曲霉毒素B1的应用，其特征在于，将所述菌株接种到LB液体培养基或营养肉汤培养基中，培养18-24h后，获得发酵培养液，或再将发酵培养液离心获得发酵上清液；或将发酵培养液离心后的沉淀干燥获得菌体干粉；将发酵培养液、发酵上清液或菌体干粉中的一种或多种加入到含有黄曲霉毒素的食品、饲料或含毒素农产品中，1mL发酵培养液稀释10-30倍用于1-3kg农产品，混合均匀，在30-40℃暗处连续反应3-4d。通过上述方法，本专利技术筛选出一株微生物菌株，通过革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，同时根据宝日医生物细菌基因组DNA提取试剂盒(TakaraBacteriaGenomicDNAExtractionKit)步骤和PCR方法提取并扩增该菌株的基因组DNA，通过测定16SrDNA的序列来进行菌种鉴定。将该菌种的所测得到的序列在GenBank数据库中进行BLAST对比分析，在比对匹配度最高的结果中发现与阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)的16SrDNA序列有100％的同源性。可确定菌种为阿耶波多氏芽孢杆菌，命名为BacillusaryabhattaiDT。该菌株的生物保藏信息为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)，菌种保藏号CGMCC14949。本专利技术的菌株能以香豆素作为唯一碳源。本专利技术筛选分离出的降解黄曲霉毒素B1的菌株DT能使2μg/mL的黄曲霉毒素B1在3天内的降解率达到82.98％，对黄曲霉毒素的降解能力优于现有商品化物理和化学方法，具有效率高、特异性强、对饲料农副产品和环境无污染等特点和优势。附图说明图1本专利技术菌株DT的平板培养性状；图2本专利技术菌株DT的革兰氏染色结果；图3本专利技术菌株DT在不同反应时间中对黄曲霉毒素B1降解效果，其中纵坐标代表黄曲霉毒素B1降解率，横坐标代表作用时间；图4本专利技术菌株DT的16SrDNA序列Neighbor-Joining系统发育树。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本专利技术的保护范围。实例1：本专利技术所述降解黄曲霉毒素的微生物菌株的快速筛选1.实施步骤从浙江省杭州市浙江大学园林研究所的果蔬园区随机采集多份土样于自封袋中，并注明采集名称、地点、时间等信息。将采集的土壤样品称5g于50mL的0.85％无菌生理盐水中，磁力搅拌振荡均匀制成土壤悬液。将土壤悬液转入已灭菌的离心管中3000-4000g下离心3-5min，取土壤悬液上层清液1mL，用浓度梯度稀释法进行逐级稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取200μL均匀涂布于以香豆素作为唯一碳源的固体培养基[成分：香豆素1g/L、KH2PO40.25g/L、CaCl2·2H2O0.005g/L、FeCl3·6H2O0.003g/L、KNO30.5g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、(NH4)2SO40.5g/L、琼脂15-20g/L]上，30-37℃下培养6-7d。待培养皿中长出菌落后，挑取单个菌落在香豆素固体培养基上进行平板划线三次后，分离单菌落。2.实施结果分析通过以香豆素为唯一碳源的培养基筛到的菌株形态呈圆形，不具有光泽，表面干燥略皱褶，边本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株，其特征在于所述菌株的分类命名为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)DT，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.14949，保藏日期为为2017年11月22日。
【技术特征摘要】
1.一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株，其特征在于所述菌株的分类命名为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)DT，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCCNo.14949，保藏日期为为2017年11月22日。2.一种权利要求1所述降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的筛选方法，其特征在于以香豆素作为唯一碳源，具体方法为：称取土壤样品加入到装有无菌生理盐水的三角瓶中，磁力搅拌振荡均匀制成悬液，将悬液转入离心管，并在3000-4000g下离心，取上清液用无菌生理盐水稀释，吸取适量稀释液涂布于香豆素固体培养基上，30-37℃下培养6-7d，待培养皿中长出菌落后，挑取单个菌落在香豆素固体培养基上进行反复分离划线，并连续三代培养获得遗传稳定性的菌株，即为所述降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株。3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述香豆素固体培养基组分为：香豆素1g/L、KH2PO40.25g/L、CaCl2·2H2O0.005g/L、FeCl3·6H2O0.003g/L、KNO30.5g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、(NH4)2SO40.5g/L，琼脂15-20g/L，余量为蒸馏水。4.一种权利要求1所述的降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的发酵培养液，其特征在于其制备方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：周文文，汤曦，郑晓冬，张一鞠，刘姝妤，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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