真菌菌株及使用方法技术

提供了改进的真菌菌株及其用途，其中这些真菌菌株能够生产改变水平的目的蛋白、酶、变体和其他物质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真菌菌株及使用方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年2月9日提交的当前未决的美国临时专利申请序列号62/113,905以及于2015年6月10日提交的美国临时专利申请序列号62/173,511的优先权。专利
本披露涉及能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株，以及遗传修饰真菌菌株使得其具有生产改变水平的目的蛋白的能力的方法。此外，本披露涉及通过使该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵生产的目的蛋白以及包含该目的蛋白的组合物。此外，本披露涉及使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株生产目的蛋白的方法，以及生产和使用包含这种目的蛋白的组合物的方法。本文中目的蛋白可以是内源蛋白质或异源蛋白质。本披露还涉及用于鉴定或选择工程改造的真菌菌株的方法，该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白。序列表的引用名称为“40733-PCT-SEQ_Listing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容是在2015年2月8日创建的，其大小为30KB，将其通过引用以其全文特此结合。对生物材料保藏的参考本申请包含对生物材料保藏的参考，该保藏通过引用结合在此。具体地，CBS140022是里氏木霉(Trichodermareesei)菌株RLP37Nik1(M743T)，根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约》(BudapestTreatyontheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsforthePurposesofPatentProcedure)的条款将该CBS140022保藏在位于荷兰乌特勒支市(Uppsalalaan8,3584CTUtrecht,theNetherlands)的荷兰皇家艺术与科学学院研究所真菌生物多样性中心真菌菌种保藏中心(CentraalbureauvoorSchimmelcultures,FungalBiodiversityCentre,InstituteoftheRoyalNetherlandsAcademyofArtsandSciences(KNAW))。
技术介绍
真菌因其商业应用(作为工业产品的内源性蛋白质，以及作为生产工业上有用的蛋白质的表达宿主两者)而众所周知。在真菌的直接工业用途的一个实例中，丝状真菌菌株例如里氏木霉(Trichodermareesei)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)等直接应用于纤维素生物质上以帮助将此类材料的纤维素和半纤维素组分分解为可以进一步被加工成工业上有用的物质的小的聚合糖和/或单体糖。然而，这样的直接用途迄今被证明在经济上不可行，主要是因为可以由这些生物体生产的总蛋白质/酶的量的固有限制，特别是当被分解顽固性底物(例如纤维素生物质)所需要的高水平的酶活性抵消时。在另一方面，使用真菌菌株作为目的蛋白的生产宿主长期以来一直被认为是经济上可行的并且在一段时间被广泛用于商业环境中。丝状真菌将精确折叠成三维结构和二硫键、在翻译后精确地进行蛋白水解剪切、并且相对可预测地用n-连接和o-连接糖基化反应进行糖基化的复杂的蛋白质分泌的能力致使这些生物体成为用于生产分泌型蛋白的高度有吸引力的宿主(MacKenzie,D.A.等人，JGenMicrobiol[普通和应用微生物学杂志](1993)139:2295-2307；Peberdy,J.F.，TrendsinBioTechnology[生物技术趋势](1994)12:50-57)。已知真菌是生物质水解、食品和饲料添加剂、纺织应用、谷物加工、清洁和其他工业用途的有效的酶生产者。使用真菌表达的蛋白质用于工业过程是广泛的且稳定增加的，特别是鉴于目前对使用涉及酶的工业过程从非石油可再生材料或来源生产燃料和化学药品的兴趣。在该领域中已经开发出了改进蛋白质表达的各种技术。这些技术包括例如经典的菌株改良方法，例如对菌株进行多轮诱变并选择高生产者、构建或遗传工程改造具有在基因组中插入的高拷贝数的目的基因的生产菌株。虽然这些方法中的许多方法在提高菌株的生产率方面是有效的，但它们具有局限性，包括例如，制备每个单独产品通常所需的菌株构建操作的劳动强度。因此，仍然需要获得能够增加对单一的目的蛋白、或目的蛋白的多个组、或甚至内源蛋白质的蛋白质生产的改进的真菌菌株。
技术实现思路
本披露涉及能够生产改变水平的目的蛋白的工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株，以及遗传修饰真菌菌株使得其具有生产改变水平的目的蛋白的能力的方法。此外，本披露涉及通过使该工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株发酵生产的目的蛋白以及包含该目的蛋白的组合物。此外，本披露涉及使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株生产目的蛋白的方法，以及生产和使用包含目的蛋白的组合物的方法。本披露还涉及用于鉴定或选择工程改造的真菌菌株的方法，该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白。在第一方面，本披露提供工程改造的真菌菌株，该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白，其中该真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因和/或表达变体组氨酸激酶。在一些实施例中，该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。在一些实施例中，该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型基因的变体。在某些实施例中，该变体组氨酸激酶基因编码作为响应外部渗透压的信号传导途径的一部分起作用的多肽。在组氨酸激酶中具有突变的菌株可以通过对某些化合物的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的二甲酰亚胺杀真菌剂例如异菌脲或咯菌腈的存在下)进行筛选来鉴定。将预期的是，在这一信号传导途径的其他组分的突变也将是有益的。这些组分包括但不限于MAP激酶蛋白和响应于渗透压调节其他基因的表达的转录因子。在该途径中具有突变的菌株可以通过对渗透胁迫的抗性或敏感性(例如像在培养基中在高水平的山梨糖醇或盐的存在下)进行筛选来鉴定。因此，与此相关，本披露还提供鉴定对渗透胁迫具有抗性或敏感性的真菌菌株的方法，该真菌菌株作为可用于生产工业上有用的分子的宿主生物体是有利的。在某些实施例中，变体组氨酸激酶基因编码如下多肽，该多肽包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:43具有至少约60％(例如，至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或甚至更高％)同一性、但不是与SEQIDNO:1或SEQIDNO:43具有100％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，这一方面的工程改造的真菌菌株的变体组氨酸激酶基因编码如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:1具有至少约60％(例如，至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或甚至更高％)同一性并且在SEQIDNO:1的位置743处具有突变。在具体实施例中，在SEQIDNO:1的位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程改造的真菌菌株，该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白，其中该工程改造的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.09 US 62/113,905;2015.06.10 US 62/173,5111.一种工程改造的真菌菌株，该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白，其中该工程改造的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因。2.一种工程改造的真菌菌株，该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白，其中该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。3.一种工程改造的真菌菌株，该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白，其中该工程改造的真菌菌株与亲本菌株相比包含导致对杀真菌剂具有改变的敏感性或抗性的突变。4.如权利要求1-3中任一项所述的工程改造的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。5.如权利要求1-3中任一项所述的工程改造的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。6.如权利要求1-5中任一项所述的工程改造的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因编码包含氨基酸序列的多肽，并且与SEQIDNO:1具有至少60％同一性，该氨基酸序列在SEQIDNO:1的位置743处包含突变。7.如权利要求1-5中任一项所述的工程改造的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因编码包含氨基酸序列的多肽，并且与SEQIDNO:43具有至少60％同一性，该氨基酸序列在SEQIDNO:43的位置786处包含突变。8.如权利要求6所述的工程改造的真菌菌株，其中在位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变，即M743T。9.如权利要求7所述的工程改造的真菌菌株，其中在位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变，即M786T。10.如权利要求1-9中任一项所述的工程改造的真菌菌株，其中该亲本菌株是子囊菌真菌菌株。11.如权利要求1-9中任一项所述的工程改造的真菌菌株，其中该亲本菌株是丝状真菌菌株。12.如权利要求1-11中任一项所述的工程改造的真菌菌株，该工程改造的真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、或至少约100％更多的目的蛋白。13.一种转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株，该转化的真菌菌株或其衍生的真菌菌株与亲本菌株相比能够生产改变水平的目的蛋白，其中该转化的真菌菌株或衍生的真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因或包含与该亲本菌株相比导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。14.如权利要求13所述的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。15.如权利要求13或14所述的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。16.如权利要求13-15中任一项所述的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQIDNO:1的位置743处的突变，以及与SEQIDNO:1具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽。17.如权利要求16所述的真菌菌株，其中在位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变，即M743T。18.如权利要求13-15中任一项所述的真菌菌株，其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQIDNO:43的位置786处的突变，以及与SEQIDNO:43具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽。19.如权利要求18所述的真菌菌株，其中在位置786处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变，即M786T。20.如权利要求13-19中任一项所述的真菌菌株，其中该亲本菌株是子囊菌真菌菌株。21.如权利要求13-19中任一项所述的真菌菌株，其中该亲本菌株是丝状真菌菌株。22.如权利要求13-21中任一项所述的真菌菌株，该真菌菌株与其亲本菌株相比能够生产至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、或至少约100％更多的目的蛋白。23.一种用于改进蛋白质生产的方法，该方法包括使用工程改造的、转化的或衍生的真菌菌株，该真菌菌株包含变体组氨酸激酶基因，或包含与该亲本菌株相比导致对外部渗透压具有改变的敏感性或抗性的突变。24.如权利要求23所述的方法，其中该变体组氨酸激酶基因是编码混合型组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。25.如权利要求23或24所述的方法，其中该变体组氨酸激酶基因是编码组III组氨酸激酶的野生型组氨酸激酶基因的变体。26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQIDNO:1的位置743处的突变，以及与SEQIDNO:1具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽。27.如权利要求26所述的方法，其中在位置743处的突变是用苏氨酸残基置换在该位置处的甲硫氨酸残基的突变，即M743T。28.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中该变体组氨酸激酶基因编码包含SEQIDNO:43的位置786处的突变，以及与SEQIDNO:43具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽。29.如权利要求28所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·A·博迪，R·拉比诺维奇，A·维拉格，M·沃德，R·恩古耶，J·A·斯韦加尔德，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国,US