提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸酸产量的方法及应用，该方法是通过敲除生产柠檬酸的黑曲霉中的葡萄糖基转移酶基因，构建基因工程菌，并将其用于柠檬酸发酵来实现。葡萄糖基转移酶基因的敲除可以使还原糖含量降低8.96‑9.89％，总糖含量降低9.78‑10.26％，异麦芽糖含量降低6.12‑7.01％，柠檬酸产量提高10.28‑12.16％，一年可以减少残糖至少约1.5万吨，具有显著的经济效益。

Methods and applications of increasing sugar utilization and citric acid production in citric acid fermentation

The invention belongs to the technical field of genetic engineering and fermentation engineering, in particular to a method and application to improve the sugar utilization and citric acid acid production in citric acid fermentation by knocking out the glucosyl transferase gene in Aspergillus niger Producing Citric Acid and constructing the genetic engineering bacteria and using it for citric acid fermentation. Realization\u3002 The knockout of the glucosyl transferase gene could reduce the reducing sugar content by 8.96 and 9.89%, the total sugar content decreased by 9.78, 10.26%, the ISO maltose content decreased by 6.12 7.01%, the citric acid yield increased by 10.28 12.16%, and at least 15 thousand tons of residual sugar could be reduced in one year, with significant economic benefits.

【技术实现步骤摘要】
提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用
：本专利技术属于基因工程和发酵工程
，具体涉及一种通过基因工程手段提高产柠檬酸工业菌株的糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用。
技术介绍
：柠檬酸(citricacid)又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羟酸(2-hydroxytricarboxylicacid)，是一种三羧酸类化合物，易溶于水，无毒，无臭，具有很强的酸味，是一种重要的、多功能的有机酸，广泛应用于食品、医药化工等领域。柠檬酸全球产量超过170万吨，随着在生物聚合、药物运输、细胞培养等新兴产业领域的广泛应用，每年以5％的速度增长，是世界第二大发酵产品，产量仅次于酒精产量。我国是柠檬酸的主要生产国和出口国，年产量占世界总产量的70％，但由于柠檬酸国际市场竞争激烈，整个柠檬酸行业处于非常困难的状况。国际上有大量的研究在不断推进柠檬酸发酵的生产工艺，同时作为发酵的基础，柠檬酸生产菌种黑曲霉的改良也一直是研究人员所关注的焦点，获得更优质的生产菌株对巩固我国柠檬酸生产大国的地位和促进柠檬酸行业的发展有重要的现实意义。尽管我国在柠檬酸发酵行业取得巨大进步，但柠檬酸发酵单位粮耗仍在1.8t左右，发酵残糖约2％-3％。目前我国柠檬酸产率在160-175g/L，按2016年我国柠檬酸产量约130万吨计算，一年发酵形成的残糖最少约15万吨，造成原料的极大浪费。因此，如何降低残糖是提高糖类利用率和柠檬酸产量的关键因素。通过对柠檬酸发酵液残糖成分进行分析，残糖的主要成分是非发酵性的异麦芽糖。异麦芽糖是由α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)的催化形成的。α-葡萄糖苷酶又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，以前称作麦芽糖酶(maltase)。葡萄糖基转移酶的功能是催化活化的葡萄糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。本申请意外地发现，敲除产柠檬酸工业菌株中的一种葡萄糖基转移酶(candidateglucosyltransferase)，可以降低残糖和异麦芽糖的含量，提高糖类利用率和柠檬酸的产量。根据NCBI的基因注释，该葡萄糖转移酶的功能是将长链醇磷酸上活化的葡萄糖基转移到Man9GlcNAc2-dolichyl-pyrophosphate上，涉及N-糖基化途径(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/134057334)，并不参加残糖和异柠檬酸的形成。因此，目前对该基因降低残糖和异麦芽糖含量的作用原理尚不清楚。本专利技术通过对产柠檬酸黑曲霉菌株的基因组进行分析和基因敲除，证明敲除该葡萄糖基转移酶基因(candidateglucosyltransferase)能够有效降低发酵液中的残糖特别是异麦芽糖的含量，提高糖类利用率和柠檬酸产量。
技术实现思路
：为了解决现有技术中柠檬酸发酵过程中形成2％-3％的残糖，导致糖利用率和柠檬酸产量低的问题，本专利技术将通过对柠檬酸生产菌株黑曲霉进行分子改造，通过农杆菌介导的方法敲除黑曲霉中一个注释为葡萄糖基转移酶(candidateglucosyltransferase)的基因，构建基因工程菌，降低发酵液中的残糖，提高糖的利用率，同时提高柠檬酸产量。所述基因工程菌通过敲除黑曲霉出发菌株中的一个葡萄糖基转移酶基因获得的；所述基因工程的出发菌株为黑曲霉γ-144或黑曲霉Co860；进一步地，所述的基因工程菌具体为黑曲霉KO-174680；所述基因工程的出发菌株还可以是黑曲霉ATCC1015；所述的葡萄糖基转移酶氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；进一步地，所述的葡萄糖基转移酶基因核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；进一步地，用于敲除葡萄糖基转移酶基因(candidateglucosyltransferase)的载体为pPZP-HYG2(WaltonFJ,etal，NovelgenefunctionsrequiredformelanizationofthehumanpathogenCryptococcusneoformans.MolecularMicrobiology(2005),57(5):1381–1396)，用于转化所述敲除载体的微生物宿主细胞为农杆菌AGL-1和黑曲霉γ-144或黑曲霉Co860或黑曲霉ATCC1015；进一步地，所述基因工程菌的构建步骤概述如下：(1)通过PCR技术扩增产柠檬酸黑曲霉基因组的葡萄糖基转移酶基因(candidateglucosyltransferase)的上游同源臂LB和下游同源臂RB。LB序列的5’端加上HindⅢ酶切位点，3’端加上SpeⅠ酶切位点；RB序列的5’端加上XhoⅠ酶切位点，3’端加上KpnⅠ酶切位点；(2)分别将LB和RB连接至载体pPZP-HYG2中潮霉素抗性基因(简写为HYG或HygR)的两端，构建敲除载体pPZP-174680；(3)将敲除载体电转入农杆菌AGL-1；(4)农杆菌介导敲除载体pPZP-174680转入黑曲霉菌株，筛选得到敲除菌株。有益效果：1、本专利技术所提供的敲除葡萄糖基转移酶基因的基因工程菌，与出发菌株相比，96h发酵结束时还原糖含量降低8.96-9.89％，总糖含量降低9.78-10.26％，异麦芽糖含量降低6.12-7.01％，柠檬酸产量提高10.28-12.16％。2、本专利技术为柠檬酸的工业化生产提供了新思路，以KO-174680为例，葡萄糖基转移酶基因的敲除可以降低残糖和异麦芽糖分别约为10.1％和6.87％，柠檬酸产率提高约11.53％，按2016年我国柠檬酸产量计算，一年可以减少残糖至少约1.5万吨，具有显著的经济效益。附图说明：图1为本专利技术构建的敲除载体质粒图谱；图2为本专利技术实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间还原糖含量测定图；图3为本专利技术实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间总糖含量测定图；图4为本专利技术实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间异麦芽糖含量测定图；图5为本专利技术实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间柠檬酸含量测定图。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术方法。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。以下实施例分别以黑曲霉γ-144、黑曲霉Co860及黑曲霉ATCC1015为出发菌株进行基因敲出和发酵验证；实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。黑曲霉γ-144、黑曲霉Co860是本领域生产柠檬酸的常用菌株，在本申请提交前已被多次公开，如：周永生，满云《我国柠檬酸行业的产业化现状及可持续发展》.生物加工过程(1672-3678.2010.06.014)；农杆菌AGL-1为本领域常用基因敲除介导细胞，保存于申请人实验室，也可购自北京华越洋生物；pPZP-HYG2质粒的构建方法参考WaltonFJ,etal，Novelge本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，通过敲除生产柠檬酸的黑曲霉菌株中的葡萄糖基转移酶来获得。

【技术特征摘要】
1.一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，通过敲除生产柠檬酸的黑曲霉菌株中的葡萄糖基转移酶来获得。2.如权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。3.如权利要求2所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的出发菌株为黑曲霉γ-144或黑曲霉Co860。5.权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌出发...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎明，路福平，魏润，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12