一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物、试剂盒及方法，涉及生物检测领域，包括用于富集BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合；以及用于标记BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的标记引物组合；所述富集引物组合利用五个富集引物组，就实现了待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集，测序后即可获得序列突变信息；所述标记引物组合利用五个标记引物组实现了BRCA1和BRCA2基因的所有外显子所在区域的特征片段的扩增，通过判断特征片段的大小和峰高，判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况。本发明专利技术所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物、试剂盒及方法。
技术介绍
BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，参与染色体损伤修复过程。BRCA1和BRCA2的突变可能造成基因功能的降低或缺失，进而增加细胞癌变的风险。现有的数据显示，这两个基因的胚系突变是造成遗传性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突变携带者一生中罹患乳腺癌的几率可高达87％，卵巢癌的几率可高达44％。因此，对高危人群进行BRCA1/2基因突变检测，对于癌症的预防，发现和治疗有着重要的指导意义。BRCA1/2的突变分为两种。第一种是单个碱基的突变或少量碱基的缺失和插入，可以造成氨基酸序列的改变，翻译提前终止，或信使RNA加工的异常，进而影响蛋白的功能。第二种是大片段DNA重组，可以造成一个或多个外显子的缺失或重复，从而扰乱基因功能。这两种突变中，第一种占大部分，并且可通过基因片段PCR扩增和Sanger测序相结合的常规方法进行检测。第二种占少部分，需要通过Southern杂交，MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)，定量PCR或CGH(comparativegenomichybridization)等较为复杂的方法来检测。第二代高通量测序技术也被运用到了BRCA1/2突变的检测中。通过高通量测序，两种类型的突变可以被同时检测。但是，利用二代测序技术进行大片段DNA重组的检测，对基因组目的区域的富集方式、测序深度和信息分析等都有特定的要求，对于很多实验室现有的检测平台来说都是非常大的挑战。所以，一种快速有效的BRCA1/2大片段重组检测技术，无论是作为独立的大片段重组检测项目，还是作为常规点突变检测的补充，都有非常重要的应用价值。BRCA1和BRCA2共有48个外显子。用Southern杂交或实时定量PCR来检测工作量大。CGH可同时检测整个基因区域，但对技术平台有很高的要求。以多重PCR为基础的检测技术操作简单，方便快捷。MLPA技术被广泛用于BRCA1/2及许多其它基因大片段DNA重组的检测，目前还存在数据变异较大的缺点，检测精确度有待提高。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术一方面设计了一套共26对扩增BRCA1和BRCA2所有外显子，和部分内含子区域，互不重叠的扩增引物。它们的扩增子长度在2kb至8kb之间，分组进行多重PCR，每个片段均能通过普通的琼脂糖凝胶电泳进行区分。本专利技术同时提供了这些引物的一种分组方式及每组引物在多重引物混合物中的浓度。将多重PCR扩增产物混合后，打碎，构建文库，进行高通量测序，结果显示各外显子及附近的内含子区域有均一的覆盖。另一方面针对BRCA1和BRCA2的各个外显子所在区域开发了一套标记引物，根据扩增产物片段大小分为五组，利用GeXP原理进行多重扩增。只需通用引物中的一条进行5’段荧光修饰。五组多重PCR产物片段大小均分布在180至500bp的范围之间。在3730xl测序仪上进行片段分析后，通过片段大小和峰高判定每个外显子的扩增强度，进而判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况。本专利技术所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术第一方面提供一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物，包括：用于富集BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合；以及用于标记BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的标记引物组合。其中，所述富集引物组合包括从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的多对富集引物中得到的五个富集引物组。其中，所述五个富集引物组是根据所述多对富集引物对BRCA1和BRCA2基因进行扩增得到的扩增片段的大小进行分组得到的，将PCR反应数降低到5个；其中，在对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行扩增时，利用所述5个富集引物组中的每个富集引物组分别对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR处理，得到五组扩增产物，实现待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集。其中，所述每组扩增产物的扩增片段之间长度有明显区别，使得扩增产物质量易于监控。其中，所述标记引物组合包括从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的多对引物中获得五个标记引物组；其中，所述五个标记引物组是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增所得的对应于BRCA1和BRCA2基因的各个外显子的不同长度的扩增子进行分组得到的；其中，所述五个标记引物组中，每组标记引物中的每个标记引物所扩增的扩增子长度均不相同，且每个长度不同的扩增子均对应BRCA1和BRCA2基因上的不同外显子所在的基因区域，从而通过检测扩增子的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。其中，所述富集引物组合具有如SEQIDNO.1-SEQIDNO.52所示的序列。特别是，所述富集引物组合包括五个富集引物组，分别为：如SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.43、SEQIDNO.44所示的第一富集引物组，其中，所述SEQIDNO.13和SEQIDNO.14、SEQIDNO.17和SEQIDNO.18、SEQIDNO.23和SEQIDNO.24、SEQIDNO.33和SEQIDNO.34、SEQIDNO.43和SEQIDNO.44为五对互为上下游组成的富集引物；如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38所示的第二富集引物组，其中，所述SEQIDNO.7和SEQIDNO.8、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12、SEQIDNO.21和SEQIDNO.22、SEQIDNO.27和SEQIDNO.28、SEQIDNO.37和SEQIDNO.38为五对互为上下游组成的富集引物；如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.35、SEQIDNO.36、SEQIDNO.39、SEQIDNO.40、SEQIDNO.41、SEQIDNO.42、SEQIDNO.49、SEQIDNO.50所示的第三富集引物组，其中，所述SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.31和SEQIDNO.32、SEQIDNO.35和SEQIDNO.36、SEQIDNO.39和SEQIDNO.40、SEQIDNO.41和SEQIDNO.42、SEQIDNO.49和SEQIDNO.50为六对互为上下游组成的富集引物；如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.15、SEQIDNO.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括：用于富集BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合；以及用于标记BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的标记引物组合；其中，所述富集引物组合从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的多对富集引物中得到的五个富集引物组；其中，所述五个富集引物组是根据所述多对富集引物对BRCA1和BRCA2基因进行扩增得到的扩增片段的大小进行分组得到的，以便将PCR反应数降低到5个；其中，在对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行扩增时，利用所述5个富集引物组中的每个富集引物组分别对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR处理，得到五组的扩增产物，实现待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集；其中，所述标记引物组合包括从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的多对引物中获得五个标记引物组；其中，所述五个标记引物组是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增的对应于BRCA1和BRCA2基因的各个外显子的不同长度的扩增子进行分组得到的；其中，所述五个引物组中，每个引物组中的每个引物所扩增的扩增子长度均不相同，且每个扩增子均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，从而通过检测扩增子的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。...

【技术特征摘要】
2016.12.29 CN 201611241733X1.一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括：用于富集BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合；以及用于标记BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的标记引物组合；其中，所述富集引物组合从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的多对富集引物中得到的五个富集引物组；其中，所述五个富集引物组是根据所述多对富集引物对BRCA1和BRCA2基因进行扩增得到的扩增片段的大小进行分组得到的，以便将PCR反应数降低到5个；其中，在对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行扩增时，利用所述5个富集引物组中的每个富集引物组分别对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR处理，得到五组的扩增产物，实现待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集；其中，所述标记引物组合包括从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的多对引物中获得五个标记引物组；其中，所述五个标记引物组是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增的对应于BRCA1和BRCA2基因的各个外显子的不同长度的扩增子进行分组得到的；其中，所述五个引物组中，每个引物组中的每个引物所扩增的扩增子长度均不相同，且每个扩增子均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，从而通过检测扩增子的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述富集引物组合具有如SEQIDNO.1、SEQIDNO.52所示的序列；所述标记引物组合具有如SEQIDNO.53-SEQIDNO.156所示的序列。3.如权利要求1所述的检测引物，其特征在于，所述标记引物组合中的每个引物均嵌有低退火温度的通用引物序列。4.如权利要求3所述的检测引物，其特征在于，所述通用引物序列如SEQIDNO.157-SEQIDNO.158所示。5.一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一所述的试剂盒，还包括：用于配合富集引物组合对待测样本进行多重PCR扩增的具有长片段扩增能力的DNA聚合酶；用于配合标记引物组合对待测样本进行多重PCR处理的低退火温度的通用引物；其中，所述富集引物组合中的每个引物的浓度都不完全相同，所述标记引物组合中的每个引物的浓度都不完全相同。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，使用所述富集引物组合的退火温度为58-64℃。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述多...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建云，汪彪，
申请(专利权)人：北京明谛生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11