一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒，本发明专利技术的引物组合中的每对引物均可从BRCA1或BRCA2基因至少一个外显子所在区域扩增得到一个特征片段，特征片段长度各不相同，经过优化后，引物分为5组，进行多重PCR扩增，每组扩增产物的长度均具有差异。多重PCR以GeXP‑PCR方式进行，PCR反应前期为特征片段的线性特异扩增，后期以通用引物对特征片段进行无差别扩增。通用引物中的一条带上适宜的荧光修饰基团，即可于相应的毛细管电泳分析仪器上进行分析，获得各特征片段的相对含量信息，进而获得相应基因区域的大片段重组突变信息。本发明专利技术所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点，与普通的终点法多重PCR相比，解决了多重扩增偏好性问题，提高了可靠性。

Primer combination, method and kit for detecting large fragment recombination of BRCA1 and BRCA2 genes

The invention discloses a reagent kit and primer combinations, methods for the detection of BRCA1 and BRCA2 gene recombinant box, each pair of primers can be primers of the invention from the BRCA1 or BRCA2 gene at least one exon region amplified a fragment characteristics, characteristics of segment length is not the same, after after optimization, were divided into 5 groups, each group of multiple PCR amplification, amplification products with different length. Multiple PCR to GeXP PCR, PCR linear characteristics of the early stage of the reaction specific fragments were amplified with universal primers of late, characteristic fragments were no difference amplification. A suitable fluorescent modification group in the universal primer can be analyzed on the corresponding capillary electrophoresis analytical instrument to obtain the relative content information of each characteristic fragment, and then obtain the large fragment recombination mutation information of the corresponding gene region. The detection method provided by the invention has the advantages of simple operation and low cost, and solves the problem of multiple amplification preference and improves the reliability compared with the common end point method of multiple PCR.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒。
技术介绍
BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，参与染色体损伤修复过程。BRCA1和BRCA2的突变可能造成基因功能的降低或缺失，进而增加细胞癌变的风险。现有的数据显示，这两个基因的胚系突变是造成遗传性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突变携带者一生中罹患乳腺癌的几率可高达87％，卵巢癌的几率可高达44％。因此，对高危人群进行BRCA1/2基因突变检测，对于癌症的预防，发现和治疗有着重要的指导意义。BRCA1/2的突变分为两种。第一种是单个碱基的突变或少量碱基的缺失和插入，可以造成氨基酸序列的改变，翻译提前终止，或信使RNA加工的异常，进而影响蛋白的功能。第二种是大片段DNA重组，可以造成一个或多个外显子的缺失或重复，从而扰乱基因功能。这两种突变中，第一种占大部分，并且可通过基因片段PCR扩增和Sanger测序相结合的常规方法进行检测。第二种占少部分，需要通过Southern杂交，多重连接探针扩增技术MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)，定量PCR或CGH(comparativegenomichybridization)等较为复杂的方法来检测。第二代高通量测序技术也被运用到了BRCA1/2突变的检测中。通过高通量测序，两种类型的突变可以被同时检测。但是，利用二代测序技术进行大片段DNA重组的检测，对基因组目的区域的富集方式、测序深度和信息分析等都有特定的要求，对于很多实验室现有的检测平台来说都是非常大的挑战。所以，一种快速有效的BRCA1/2大片段重组检测技术，无论是作为独立的大片段重组检测项目，还是作为常规点突变检测的补充，都有非常重要的应用价值。BRCA1和BRCA2共有48个外显子。用Southern杂交或实时定量PCR来检测工作量大。CGH可同时检测整个基因区域，但对技术平台有很高的要求。以多重PCR为基础的检测技术操作简单，方便快捷。MLPA技术被广泛用于BRCA1/2及许多其它基因大片段DNA重组的检测，目前还存在数据变异较大的缺点，检测精确度有待提高。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术针对BRCA1和BRCA2的所有外显子开发了一套引物，根据产物片段大小，将一套引物分为五组，利用GeXP原理，通过五组引物对待测样本进行多重扩增。利用五组引物进行多重PCR的产物片段大小分布在180至500bp的范围之间。利用一条通用引物上的荧光修饰使所有扩增片段一端带上荧光基团，通过毛细管电泳DNA分析仪进行片段分析后，通过片段大小识别特征片段，通过峰高判定每个外显子所在区域的扩增强度，进而判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况。本专利技术所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术第一方面提供一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合，所述引物组合包括：从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的多对引物中获得五个引物组；其中，所述五个引物组是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增片段长度差异及其在BRCA1和BRCA2基因上的分布优化分组得到的；其中，所述五个引物组中，每组引物中的每对引物所扩增的扩增产物片段长度均不相同，且每个扩增产物均代表BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子所在的区域，从而通过检测扩增产物的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。其中，所述五组引物对为：如SEQIDNO.1-SEQIDNO.20所示的第一组引物对；如SEQIDNO.21-SEQIDNO.44所示的第二组引物对；如SEQIDNO.45-SEQIDNO.64所示的第三组引物对；如SEQIDNO.65-SEQIDNO.84所示的第四组引物对；如SEQIDNO.85-SEQIDNO.104所示的第五组引物对。其中，所述五组引物组＝对中的每对引物上均嵌有低退火温度的通用引物序列。其中，所述通用引物序列如SEQIDNO.105-SEQIDNO.106所示。其中，所述通用引物中的一条5’端是经过荧光修饰的。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术第二方面提供一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的方法，包括：设计用来分别特异扩增BRCA1和BRCA2基因各个外显子所在区域特征片段的多对引物；通过将所述多对引物混合进行多重PCR扩增，得到包括从各个外显子所在基因区域扩增来的多个扩增片段；根据所得到多个扩增片段长度，对所述多对引物进行分组，使每组引物对中的所有引物分别对应于不同长度的扩增片段，从而得到五组引物对；利用所述五个引物组中的每组引物对分别对待测样本进行多重PCR处理，获得每组均有多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增产物的五组产物；根据所获得的每组中的多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增产物的峰高，获得BRCA1和BRCA2基因各个外显子所在区域的大片段重组突变信息。其中，每组扩增产物中的各个片段间至少存在10bp的长度差异。本专利技术的引物所扩增出的每个片段长度均具有10bp以上的差异，因此利用每组多重扩增产物中各片段的长度可以识别这一片段所代表的外显子区域，利用毛细管电泳所获得每个片段的峰高数据就可以反映出得BRCA1和BRCA2基因各个外显子的信息，通过对峰高数据进行归一化后，即可获得各个片段的相对含量信息，从而得到基因区域在基因组中的相对含量，进而判断各个外显子所在区域的大片段重组突变信息。其中，所述五个引物组为：如SEQIDNO.1-SEQIDNO.20所示的第一引物组；如SEQIDNO.21-SEQIDNO.44所示的第二引物组；如SEQIDNO.45-SEQIDNO.64所示的第三引物组；如SEQIDNO.65-SEQIDNO.84所示的第四引物组；如SEQIDNO.85-SEQIDNO.104所示的第五引物组。其中，所述五个引物组中的每一个引物上均嵌有低退火温度的通用引物序列。其中，所述通用引物序列如SEQIDNO.105-SEQIDNO.106所示。其中，所述利用所述五个引物组对待测样本进行多重PCR处理时还包括如SEQIDNO.105-SEQIDNO.106所示通用引物。其中，所述通用引物的5’端具有荧光修饰。其中，所述利用五个引物组中的每组引物对分别对待测样本进行多重PCR处理的反应体系为：特别是，所述多重PCR处理包括三个阶段。其中，第一阶段的退火温度低于第二个阶段的退火温度，第二阶段的退火温度高于第三阶段的退火温度。特别是，第一阶段的循环数低于第三阶段的循环数，第二阶段的循环数低于第三阶段的循环数。尤其是，所述第一阶段的退火温度为56℃，第二阶段的退火温度为65℃，第三阶段的退火温度为48℃。特别是，所述多重PCR处理的第一个阶段是，5℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，十个循环。特别是，所述多重PCR处理的第二个阶段是，5℃变性30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的多对引物中获得五组引物对；其中，所述五组引物对是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增片段长度差异及其在BRCA1和BRCA2基因上的分布优化；其中，所述五组引物对中，每组引物对中的每对引物所扩增的扩增产物长度均不相同，且每个扩增产物均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，从而通过检测扩增产物的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。

【技术特征摘要】
2016.12.29 CN 201611241596X1.一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的多对引物中获得五组引物对；其中，所述五组引物对是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增片段长度差异及其在BRCA1和BRCA2基因上的分布优化；其中，所述五组引物对中，每组引物对中的每对引物所扩增的扩增产物长度均不相同，且每个扩增产物均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，从而通过检测扩增产物的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述五个引物组为：如SEQIDNO.1-SEQIDNO.20所示序列的第一组引物对；如SEQIDNO.21-SEQIDNO.44所示序列的第二组引物对；如SEQIDNO.45-SEQIDNO.64所示序列的第三组引物对；如SEQIDNO.65-SEQIDNO.84所示序列的第四组引物对；如SEQIDNO.85-SEQIDNO.104所示序列的第五组引物对；其中，每个标记引物组中从第一个序列开始，每相邻的两个序列为一对互为上下游的引物。3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述五个引物组中的每一个引物上均嵌有低退火温度的通用引物序列。4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述通用引物序列如SEQIDNO.105-SEQIDNO.106所示。5.一种用于检测BRCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建云，汪彪，
申请(专利权)人：北京明谛生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11