高成长肠病毒71型病毒株及其疫苗制造技术

本发明专利技术是关于一种用于提高哺乳动物疫苗产量的驯化肠病毒71型(EV71)疫苗株。该EV71疫苗株包含至少一个经修饰的肠病毒蛋白，可自哺乳动物宿主细胞(如Vero细胞)快速增殖EV71病毒。本发明专利技术亦关于一种从驯化的EV71病毒疫苗株产生的疫苗以及该疫苗的制造方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高成长肠病毒71型病毒株及其疫苗
本专利技术是关于一种分离出的肠病毒71型(EV71)疫苗株，尤其关于一种肠病毒71型(EV71)B5基因型疫苗病毒株，该病毒株可在哺乳动物宿主细胞(如Vero细胞)快速成长，以及诱导交叉反应中和抗其他基因型的EV71病毒的抗体效价。
技术介绍
肠病毒71型(EV71)与其他重要的人类病原体，如脊髓灰质炎病毒和鼻病毒，同属于小核糖核酸病毒科肠病毒属的正股RNA病毒。EV71最早在l969年分离自一患有神经系统疾病的美国病童，但依据近来的文献回顾研究显示，早在1963年EV71就已在荷兰出现(VanDerSaden等人，2009年)。该EV71基因组转译为一有单一开放读序框且接续有一多腺嘌呤序列段(polyAtract)的长聚蛋白，该单一多蛋白的5’及3’两端均有未转译区，且可被分成三个不同的基因组区块(P1、P2和P3)，其中P1基因可再分成VP1～VP4。根据针对最易变VP1基因的亲源分析，EV71可分为3个主要基因型组(A、B和C)，其中包括11个基因型(A、B1B5和C1C5)(Solomon等，2010年)。自1997年以来，不同基因型的EV71已经在马来西亚、中国台湾、新加坡、文莱、越南、柬埔寨和中国等亚洲国家或地区引发威胁生命的疾病，并造成严重的神经系统并发症。因此，开发EV71疫苗是这些国家的优先政策。根据过去使用脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV，即小儿麻痹疫苗)的经验，依IPV的法规管制策略，开发EV71全病毒灭活疫苗被认为是可行的。在1975年保加利亚的疫情后，吾人在莫斯科依照IPV的类似制造方式制作了EV71全病毒候选灭活疫苗，并在1976年于保加利亚进行了评估，该EV71候选疫苗耐受性良好，且在1～4岁儿童身上产生免疫性。由于EV71没有进一步爆发，并未针对该保加利亚候选疫苗更进一步评估其临床疗效，亦未开发效力分析法(potencyassay)以量化疫苗抗原(黄氏等人，2011年)。在此背景下，EV71灭活疫苗的前景可期，事实上已有5个候选疫苗在进行临床试验评估。目前，共计有5个候选疫苗分别在中国(3个候选疫苗在第三阶段)、新加坡(1个候选疫苗在第一阶段)、中国台湾(1个候选疫苗在第一阶段)进行临床试验评估，如表1所列。表1.临床试验评估中的EV71候选疫苗5个候选疫苗中有4个使用Vero细胞(生产人类疫苗常用的一种细胞株)，但病毒效价的峰值只能达到107TCID50/ml左右(Chouetal.2012；Liangetal.2012)。整体来说，这5个候选疫苗在可用于疫苗生产的细胞中的生长情况并不佳(～107PFU/ml)。此外，这5个候选疫苗的基因型包括B2(新加坡)、B4(中国台湾)，和三个C4(中国)的病毒株，并非目前在中国台湾和东南亚流行的B5基因型。
技术实现思路
本专利技术是将B5基因型EV71疫苗病毒分离出来，并驯化成在使用无血清培养基的Vero细胞中可迅速生长。因此，本专利技术一方面是关于一可在哺乳动物宿主细胞内快速成长且适合于增加哺乳动物宿主细胞的EV71疫苗产量的分离的B5基因型EV71疫苗病毒。在某些实施例中，该分离的B5基因型EV71疫苗病毒包含一个以上的EV71基因，且该EV71基因可转译至少一经修饰的肠病毒蛋白以促进哺乳动物宿主细胞内的EV71病毒快速生长。较佳地，该肠病毒71型基因是分离及/或鉴定自一B5基因型的EV71病毒，如EV71B5-141。在某些实施例中，该分离出的B5基因型的EV71疫苗病毒包含至少一个位于选自P1-VP4、P1-VP1、P3-3A及P3-3D蛋白的EV71蛋白编码序列变异。另一个方面，本专利技术是关于一种EV71疫苗。该疫苗包含本专利技术的分离自B5基因型的EV71疫苗病毒株及药学上可接受的载体。更进一步而言，本专利技术是关于一制备EV71疫苗的方法，亦提供可编码一修饰EV71B5蛋白的分离的核酸分子，及分离的修饰EV71B5蛋白。本专利技术的其它面向、特征和优点在下面的说明、关于本专利技术的详细描述和权利要求中，是显而易见的。附图说明图1是使用无血清培养基(VP-SFM)在Vero细胞驯化高成长肠病毒71型的流程图；图2是EV71B5-141以及二Vero细胞驯化的病毒的蚀斑形态。图2A显示EV71B5-141、4-2及6-5病毒在6孔培养盘的无血清培养基(VP-SFM)中Vero细胞上的蚀斑分析结果。图2B显示EV71B5-141病毒、4-2及6-5在12孔培养盘的无血清培养基(VP-SFM)中Vero细胞上的免疫蚀斑分析结果。具体实施方式下列实施例将进一步说明本专利技术的其它特征和优点，但该等实施例仅为示例而用，并非对本专利技术的限制。本文中的“修饰病毒株”是指病毒株在哺乳动物宿主细胞通过连续继代及/或亲本病毒的选择及其后代所获得的病毒株。在本专利技术的一个实施例中，修饰病毒株在哺乳动物宿主细胞的病毒产量较亲本病毒为高。本文中的“肠病毒蛋白”是指由EV71病毒基因编码的任何多肽或蛋白质。本文中的“EV71病毒基因”可以是任何自EV71病毒分离及/或其相同的基因，该EV71病毒基因可以是由一B5基因型EV71病毒分离及/或其相同的基因。EV71B5-141病毒基因组的核苷酸序列全长列于SEQIDNO.2。本文中的“修饰肠病毒蛋白”是指将一未修饰或一参考肠病毒蛋白的一个以上的胺基酸序列进行修饰。举例而言，所述修饰包括插入、取代或删除一未修饰或一参考肠病毒蛋白的胺基酸残基。因此，该修饰肠病毒蛋白可以有一个以上的修饰胺基酸残基及/或在一未修饰或参考蛋白上有特定位置的密码子。实验例高成长的疫苗病毒在Vero细胞中的驯化方法细胞、培养基及病毒:依照标准程序(Wu等人，2001年、Huang等人，2010年)在人横纹肌肉瘤(RD)细胞和非洲绿猴肾(Vero)细胞中培养肠病毒71型。病毒学测定：病毒感染性效价测试是以50％的组织培养感染剂量(TCID50)观测细胞病变效应(CPE)，并测定蚀斑形成单位(PFU)进行蚀斑分析(Huang等人，2010年)。亦包含一预先设定容许范围的正对照组以进行TCID50及蚀斑分析。病毒在细胞培养中的生长曲线测定：在6孔培养盘中培养EV71病毒，并在感染后的第1至6日取其上清液以测定病毒感染效价。在含有血清的培养基中进行微载体细胞培养系统，以评估使用Vero细胞驯化的EV71病毒株作为疫苗种子病毒的效果。依据制造商的使用指南，将Cytodex1微载体(GEHealthcare,美国)进行水合、高压灭菌等预处理。Vero细胞在不同的培养条件下的生长曲线是以100毫升旋转瓶(使用体积为50毫升)测试，并对微载体进行取样以计算每日的细胞密度。当细胞在微载体上长满时，加入EV71病毒以感染细胞。病毒颗粒的纯化：疫苗抗原是以超速离心来纯化，并使用SDS-PAGE，WesternBlot和电子显微镜(Chia等人,2014年)来评估疫苗抗原的纯度。家兔的免疫原性研究：近来我们已开发了家兔模式，该模式可引发类似于EV71型感染幼儿的交叉反应中和抗体的情境(Chia等人，2014年)。家兔模式被用来评估Vero细胞驯化的疫苗病毒的免疫原性。血清分析：使用实验室方法，按照标准程序(Huang等人，2010年)测定EV71本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的B5基因型EV71疫苗病毒，包含至少一个编码一个以上的修饰肠病毒蛋白的EV71基因，其特征在于，其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒可在哺乳动物宿主细胞快速生长，并适用于增加EV71疫苗在哺乳动物宿主细胞的产量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.09 US 62/130,5841.一种分离的B5基因型EV71疫苗病毒，包含至少一个编码一个以上的修饰肠病毒蛋白的EV71基因，其特征在于，其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒可在哺乳动物宿主细胞快速生长，并适用于增加EV71疫苗在哺乳动物宿主细胞的产量。2.如权利要求1所述的分离的B5基因型EV71疫苗病毒，其特征在于，其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒包含至少一个位于对应一选自P1-VP4(SEQIDNo.3)、P1-VP1(SEQIDNo.5)、P3-3A(SEQIDNo.7)和P3-3D(SEQIDNo.9)蛋白的EV71B5蛋白的胺基酸残基上的胺基酸残基取代。3.如权利要求2所述的分离的B5基因型EV71疫苗病毒，其特征在于，其中该分离的B5基因型EV71疫苗病毒包含：(a)一修饰肠病毒P1-VP4蛋白，其具有一位于对应EV71B5蛋白(SEQIDNo.1)的胺基酸残基Thr7的胺基酸残基取代，其中该修饰肠病毒P1-VP4蛋白的Thr(T)被取代为Ala(A)；(b)一修饰肠病毒P1-VP4蛋白，其具有一位于对应EV71B5蛋白(SEQIDNo.1)的胺基酸残基Thr802的胺基酸残基取代，其中该修饰肠病毒P1-VP4蛋白的Thr(T)被取代为Asn(N)；以及(c)一修饰肠病毒P1-VP4，其具有一位于对应EV71B5蛋白(SEQIDNo.1)的胺基酸残基Pro811的胺基酸残基取代，其中该修饰肠病毒P1-VP4蛋白的Pro(P)被取代为Ala(A)。4.如权利要求2所述的分离的B5基因型EV71疫苗病毒，其特征在于，其中该分离的B...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏西，
申请(专利权)人：财团法人卫生研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71