运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法技术

本发明专利技术提出了sgRNA/CRISPRi在非分裂的神经元细胞中进行基因改造中的用途。发明专利技术人发现，sgRNA/CRISPRi在神经元中可以阻止靶向基因转录起始，提高单个细胞水平的表型均一性，并呈现卓越的靶向基因的特异性表达沉默。本发明专利技术是通过病毒传递CRISPRi策略快速而高效地实现神经元中基因失活，建立原代神经元和动物模型，为神经生物学研究提供灵活而多样的基因操作工具。

Rapid construction of acute brain science research model using CRISPRi gene knockdown Technology

The invention provides the use of sgRNA/CRISPRi in genetic modification of non dividing neuronal cells. The inventor found that sgRNA/CRISPRi can prevent the target gene transcriptional initiation, improve the phenotypic homogeneity of the single cell level, and present the specific expression silencing of the excellent target gene. The invention is a rapid and efficient method for gene inactivation in neurons through the virus transmission CRISPRi strategy, to establish primary neurons and animal models, and to provide a flexible and diverse gene manipulation tool for neurobiological research.

【技术实现步骤摘要】
运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法
本专利技术涉及基因编辑领域，具体地，本专利技术涉及sgRNA/CRISPRi在非分裂的神经元细胞中进行基因改造中的用途、快速地构建神经生物学研究的细胞和动物模型的方法。
技术介绍
来自细菌和古生菌的CRISPR/Cas9系统已被开发为基因组编辑工具，广泛地用于建立转基因细胞株和动物系。在向导RNA(sgRNA)的指引下，Cas9识别特定的目标基因组区域并引入双链断裂缺口(DSB)，随后细胞主要以随机修复方式完成缺口修补。实现精确的基因操作，目前主要依赖于转基因动物操作平台，基因敲除/敲入的效率以及冗长的制作周期仍然限制遗传操作的动物在实验室里更广泛的应用。基于各类病毒工具发展的基因编辑技术，能够在动物出生后的各个阶段，并且在生理及病理状态下实现在体操作，从分子到细胞，从环路到行为，解析基因型/表型关联，探索脑疾病的致病机制，并在此基础上寻求新的有效的治疗策略。单个基因可能在生物学过程中发挥着至关重要的作用之外，很多生命过程需要多基因或者信号通路协作完成。迄今为止，在细胞和动物整体水平阐释多基因复杂精神疾病以及蛋白质复合物的动态功能仍旧是生物学研究中的极大挑战，这对于理解疾病进程和蛋白质互作的全新模式具有重大的意义。大脑中由多种不同类型的神经元组成，它们在生命过程中以及神经疾病进程中发挥着不同的作用。例如多巴胺能，5-羟色胺能，小清蛋白和生长抑素能中间神经元活性的紊乱与精神疾病和神经退行性疾病等密切相关。干扰神经元活动是研究特定神经元亚群以及与之关联的环路/行为变法的重要方法。因而，灵活的特定神经元亚群的基因干扰工具将有助于阐释基因-神经元亚群-环路-行为的模式。本领域中仍然亟需开发简便易行的基因干扰工具，获得单个或者多重基因敲低的，以及特定神经元亚群的细胞或者动物的基因失活的研究模型。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下问题或事实的发现而提出的：一方面，专利技术人发现，由于神经元随机修复DNA的缘故，在单个神经元水平可能产生多种不一样的基因型/表型变化，例如野生型，嵌合型，完全失活型，甚至功能获得型等。并且，终端分化的神经元具有不可分裂的特性，因而神经元细胞难以像分裂的细胞建立基因型均一的细胞株供研究使用。另一方面，现有技术中，利用不同品系的小鼠杂交获得多重基因失活的神经元或者动物模型的方法，不仅耗费时间和研究经费，而且缺乏靶向任意多重基因组合的灵活多变性。在出生后小鼠直接注射携带CRISPR/Cas9基因编辑系统的病毒，可以获得多重基因失活的细胞或者动物模型，但是它们靶向的多个基因常常呈现多种的嵌合组合失活，并且它们全部同时失活的神经元比例一般不超过20％，因此这样多个基因嵌合组合失活的模式在单细胞水平极有可能产生混淆的表型。专利技术人通过实验意外地发现，sgRNA/CRISPRi能提高单个神经元水平的表型均一性，在神经元中呈现卓越的靶向基因的特异性基因沉默。本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造中的用途。专利技术人发现，sgRNA/CRISPRi在非分裂细胞中可以阻止靶向基因转录起始，提高单个细胞水平的表型均一性，在非分裂细胞中呈现卓越的靶向基因的特异性表达沉默。根据本专利技术的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述非分裂的细胞为神经元细胞。利用根据本专利技术实施例的sgRNA/CRISPRi方法，单个神经元水平的表型更加均一，在神经元中呈现更加卓越的靶向基因的特异性基因沉默。根据本专利技术的实施例，所述神经元细胞为兴奋性谷氨酸能神经元或抑制性中间神经元。利用根据本专利技术实施例的sgRNA/CRISPRi方法，可实现神经元亚群中的靶向基因的表达调控。根据本专利技术的实施例，所述基因改造是通过如下方式实现的：将无内毒素的sgRNA/CRISPRi表达质粒与pVSVG，psPAX2导入受体细胞，以便获得携带有sgRNA/CRISPRi的慢病毒，所述sgRNA/CRISPRi为靶向基因的sgRNA/CRISPRi；以及利用所述慢病毒感染所述神经元细胞。进而阻止靶向基因转录起始。根据本专利技术的实施例，所述受体细胞为HEK293FT细胞。根据本专利技术的实施例，所述导入是PEI介导的。根据本专利技术的实施例，所述基因为神经元中表达基因或外源基因。根据本专利技术的具体实施例，所述基因可以选自Syt1、Vamp2、Stx1a、Snap25、Stx1b、Doc2a、Doc2b以及DsRed的至少之一。根据本专利技术的实施例，所述sgRNA靶向基因转录起始区附近。根据本专利技术的具体实施例，所述sgRNA靶向基因转录起始区的上游-50bp～下游300bp。进而sgRNA可以靶向神经元中的单个蛋白质编码基因，阻止靶向基因转录起始，引起基因表达下调，从而进行基因功能性鉴定。根据本专利技术的实施例，所述sgRNA具有SEQIDNO:1～15所示的核苷酸序列。具有SEQIDNO:1～15所示的核苷酸序列的sgRNA靶向Syt1、Vamp2、Stx1a、Snap25、Stx1b、Doc2a、Doc2b以及DsRed，阻止上述基因的表达。根据本专利技术的实施例，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)将退火的所述sgRNA插入到BsmbI消化的所述初始慢病毒质粒，以获得单个sgRNA/CRISPRi的一体化表达质粒。进而，sgRNA可以靶向神经元中的单个蛋白质编码基因，引起基因表达下调，从而进行基因功能性鉴定。根据本专利技术的实施例，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)提供模板质粒，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件；(3)通过PCR扩增所述模板质粒，其中，PCR正向引物3’端包括所述第一sgRNA骨架序列的5’端序列，所述PCR正向引物5’端具有BsmbI识别序列和待插入第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端包括所述人源H1启动子序列的3’端序列，所述PCR反向引物的5’端具有带插入第二sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；(4)将(3)中的PCR扩增产物用BsmbI消化后，与所述初始慢病毒质粒连接，以获得两个sgRNA/CRISPRi一体化表达质粒。需要说明的是，本申请所述的“骨架序列”为tracrRNA部分，它为crRNA发挥作用提供骨架支持，一般为不变的序列；本申请所述的“第一或者第二sgRNA序列”为靶向目的基因的20bp序列，即crRNA。进而两个sgRNA可以分别靶向两个在功能上有关联的基因，在细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】
sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造中的用途。

【技术特征摘要】
1.sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非分裂的细胞为神经元细胞，任选地，所述神经元细胞为兴奋性谷氨酸能神经元或抑制性中间神经元，任选地，所述基因改造是通过如下方式实现的：将无内毒素的sgRNA/CRISPRi表达质粒与pVSVG，psPAX2导入受体细胞，以便获得携带有sgRNA/CRISPRi的慢病毒，所述sgRNA/CRISPRi为靶向基因的sgRNA/CRISPRi；以及利用所述慢病毒感染所述神经元细胞；任选地，所述受体细胞为HEK293FT细胞；任选地，所述导入是PEI介导的。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述基因包括选自Syt1、Vamp2、Stx1a、Snap25、Stx1b、Doc2a、Doc2b以及DsRed的至少之一。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述sgRNA靶向基因转录起始区的上游-50bp～下游300bp；任选地，所述sgRNA具有SEQIDNO:1～15所示的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)将退火的所述sgRNA插入到BsmbI消化的所述初始慢病毒质粒，以获得单个sgRNA/CRISPRi的一体化表达质粒。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)提供模板质粒，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件；(3)通过PCR扩增所述模板质粒，其中，PCR正向引物3’端包括所述第一sgRNA骨架序列的5’端序列，所述PCR正向引物的5’端具有BsmbI识别序列和待插入第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端包括所述人源H1启动子序列的3’端序列，所述PCR反向引物的5’端具有待插入第二sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；优选地，所述PCR正向引物和反向引物具有SEQIDNO:16或17所示的核苷酸序列；(4)将(3)中的PCR扩增产物用BsmbI消化后，与所述初始慢病毒质粒连接，以获得两个sgRNA/CRISPRi表达质粒，优选地，所述聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件紧密连接。7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚骏，郑毅，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11