用于HIV的治疗的基因疗法及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种表达载体，包括(i)至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列；以及(ii)至少由编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列、编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列、编码HIV复制抑制剂的核酸序列和编码病毒进入的抑制剂的核酸序列组成的组别中选择的另外两种核酸序列。在一个单独的表达载体中结合这三种机制提供了抑制HIV‑1的新方法。

Gene therapy and its use for the treatment of HIV

The present invention provides an expression vector including (I) a nucleic acid sequence of at least one encoding gene silencing element; and (II) a nucleic acid sequence of at least a nucleic acid molecule that encodes a HIV common receptor, a nucleotide sequence encoding a HIV fusion inhibitory protein, a nucleic acid sequence of a coded HIV replication inhibitor, and inhibition of the entry of the encoded virus. The other two nucleic acid sequences selected from the nucleic acid sequence of the agent. The combination of these three mechanisms in a single expression vector provides a new method to inhibit HIV 1.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于HIV的治疗的基因疗法及其用途相关申请本申请要求申请号为“62/163,332”、申请日为2015年5月18号的美国临时申请的权益。在此通过引用，将其整体并入本文。
总体来说，本专利技术涉及分子生物学和病毒学领域。特别地，本专利技术涉及用于治疗和预防HIV感染的表达载体，以及在组织培养系统、在动物模型系统和HIV-1感染的受体中抑制HIV感染和复制的方法。
技术介绍
HIV-1是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，在全世界有大约3000万人感染。HIV导致免疫系统衰退，并增加因机会性感染而死亡的可能性。HIV感染是一个重大的全球健康问题，世界卫生组织称其为大流行性疾病。大多数感染艾滋病毒的人，特别是在发展中国家，最终发展成艾滋病，每年有一百万多人死于艾滋病。HIV-1属于病毒逆转录病毒家族，是一种包膜病毒，它的基因组由两条单链RNA分子(ssRNA)组成。HIV-1的主要靶点是CD4+表达细胞，如CD4+T细胞。HIV-1病毒的糖蛋白与靶细胞的CD4分子和趋化因子共受体、CCRS或CXCR4在靶细胞的表面相互作用。融合和进入到靶细胞后，包含病毒基因组的核壳体分解，将包括ssRNA的病毒的内容物释放进入细胞质。HIV-1的逆转录(RT)酶从ssRNA基因组合成双链DNA(dsDNA)。双链HIV-1DNA分子合成后，HIV-1的DNA被整合到宿主基因组中。整合的HIV-1DNA的两侧是相同的5’和3’长末端重复序列(LTR)，在这里HIV-1可以启动整合HIV-1基因组的转录。病毒DNA的转录需要转录因子，比如在活化T细胞中被上调的NF-kB。因此，T细胞活化后，T细胞内病毒转录最活跃，如感染期间。由整合的HIV-1基因组转录产生的病毒RNA随后被翻译并被包装成病毒颗粒，然后离开细胞成为传染性病毒。HIV-1感染的治疗方法包括联合抗逆转录病毒疗法(cART)。cART减缓HIV发展，其包括核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、整合酶和融合抑制剂的联合。这相应地大大降低了世界上该种治疗方法存在的地区的HIV/AIDS的发病率和死亡率。然而，cART并不能治愈或者完全消除HIV/AIDS的所有病症。cART治疗方法也受到耐药突变的影响，并且有一系列副作用，这些副作用是严重的，而且似乎是累积的。此外，cART治疗方法的中断几乎总是导致可检测病毒复制的再次出现和AIDS的进展，并且已显示与所有死亡原因和严重非艾滋病事件的发生率增加有关。因此，以及cART的高成本和严格的依从性，这种治疗对于许多病人来说是相对无效的。基于HIV的慢病毒载体正在迅速成为用于研究和临床基因转移应用的所选择的逆转录病毒载体系统。增强能力的慢病毒载体转导静止期干细胞和非分裂终末分化细胞已经导致多种治疗基因递送载体的开发，以及有前途的研究工具的开发，比如短发夹RNA(shRNA)基因敲除库和在终末分化细胞诱导多能性的载体。早期的γ逆转录病毒的临床基因治疗载体恢复了患有X连锁重症联合免疫缺陷(SCID-X1)的患者的免疫功能，但是它们随后被发现通过原癌基因的反式激活引起增殖性疾病。新的慢病毒载体设计可以显著降低这种风险，它们等待临床检验，以验证其被预测的安全性。该领域仍在不断变化，临床试验的结果是不可预测的。例如，Trobridge等，PLoSOne,Vol.4:e7693,2009(以下简称“Trobridge”)教导在同一表达载体中插入聚合酶III驱动shRNA作为由一个独立的启动子驱动的C46融合抑制剂基因导致与不包括shRNA的载体相比C46表达的明显降低(参见Trobridge第5页、左栏、第1段和图3)。因此，与独自编码C46融合抑制剂的载体相比(参见Id)，双载体对抗HIV感染的效率是非常低的(超过27倍不太有效)。此外，与独自编码C46融合抑制剂的载体相比(参见第6和7页、表1和图6)，双载体展示了抗HIV基因向造血细胞的转移速率大大降低。Trobridge认为C46的低表达归结为载体中包含shRNA编码序列(参见第7页、右栏、第一段和图9、左栏、第三段)。Trobridge还公开了低量基因转移水平是抗HIV基因治疗方法临床试验的主要障碍(参见摘要、第2页、左栏、第1段整段和第8页、右栏、第2段整段)。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于治疗、预防和/或减少HIV感染的新的治疗方法，其中，在病毒感染中通过基因治疗的不同步骤的组合是靶向的。例如，本专利技术提供了编码病毒进入宿主细胞抑制剂、编码病毒融合抑制剂和/或编码病毒复制抑制剂和编码HIV-1基因转录抑制剂的载体。本专利技术的一些方面是表达载体。因此，根据本专利技术的一个方面是表达载体包括(i)至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列；以及(ii)至少由编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列、编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列、编码HIV复制抑制剂的核酸序列和编码病毒进入的抑制剂的核酸序列组成的组别中选择的另外两种核酸序列。在一些实施例中，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列是沉默核酸，将HIV的5′LTR的序列作为目标。在一些实施例中，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列选自由以下组成的组：(i)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约143到位置约161的序列作为目标，(ii)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约136到位置约154的序列作为目标，(iii)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约205到位置约223的序列作为目标，以及(iv)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约350到位置约368的序列作为目标(本文中从位置350到位置368的序列也被称为“PromA”)。在一些实施例中，所述至少两种其他的核酸序列包括编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列以及编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列。在其他实施例中，所述至少两种其他的核酸序列包括编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列以及编码HIV复制抑制剂的核酸序列。在一些实施例中，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列选自由以下组成的组：(i)沉默核酸，将序列SEQIDNO:1作为目标，(ii)沉默核酸，将序列SEQIDNO:9作为目标，(iii)沉默核酸，将序列SEQIDNO:17作为目标，(iv)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:1有至少95％同一性的序列作为目标，(v)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:9有至少95％同一性的序列作为目标，(vi)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:17有至少95％同一性的序列作为目标，(vii)沉默核酸，将序列SEQIDNO:36作为目标，以及(viii)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:36有至少95％同一性的序列作为目标。在一些实施例中，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列是包括有义链和反义链的RNA双链，其中有义链包括与序列SEQIDNO:6、序列SEQIDNO:14、序列SEQIDNO:22或序列SEQIDNO:40中的一个有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列是siRNA，选自由以下组成的组：(i)siRNA，包括含有序列SEQIDNO:6的有义链和包括含有序列SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，包括：(i)至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列；以及(ii)至少由编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列、编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列、编码HIV复制抑制剂的核酸序列和编码病毒进入的抑制剂的核酸序列组成的组别中选择的另外两种核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.18 US 62/163,3321.一种表达载体，包括：(i)至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列；以及(ii)至少由编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列、编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列、编码HIV复制抑制剂的核酸序列和编码病毒进入的抑制剂的核酸序列组成的组别中选择的另外两种核酸序列。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列是将HIV的5′LTR的序列作为目标的沉默核酸。3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列选自由以下组成的组：(i)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约143到位置约161的序列作为目标，(ii)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约136到位置约154的序列作为目标，(iii)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约205到位置约223的序列作为目标，以及(iv)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约350到位置约368的序列作为目标。4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列选自由以下组成的组：(i)沉默核酸，将序列SEQIDNO:1作为目标，(ii)沉默核酸，将序列SEQIDNO:9作为目标，(iii)沉默核酸，将序列SEQIDNO:17作为目标，(iv)沉默核酸，将序列SEQIDNO:36作为目标，(v)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:1有至少95％同一性的序列作为目标，(vi)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:9有至少95％同一性的序列作为目标，(vii)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:17有至少95％同一性的序列作为目标(viii)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:36有至少95％同一性的序列作为目标。5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列是包括有义链和反义链的RNA双链，其中有义链包括与序列SEQIDNO:6、序列SEQIDNO:14、序列SEQIDNO:22和序列SEQIDNO:40中的一个有至少95％同一性的序列。6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列是siRNA，选自由以下组成的组：(i)siRNA，包括含有序列SEQIDNO:6的有义链和包括含有序列SEQIDNO:7的反义链；(ii)siRNA，包括含有序列SEQIDNO:14的有义链和包括含有序列SEQIDNO:15的反义链；(iii)siRNA，包括含有序列SEQIDNO:22的有义链和包括含有序列SEQIDNO:23的反义链；以及(iv)siRNA，包括含有序列SEQIDNO:40的有义链和包括含有序列SEQIDNO:41的序列的反义链。7.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少一种编码转录基因沉默元件的核酸序列是shRNA，选自由以下组成的组：(i)具有序列SEQIDNO:8的shRNA；(ii)具有序列SEQIDNO:16的shRNA；(iii)具有序列SEQIDNO:24的shRNA；以及(iv)具有序列SEQIDNO:42的shRNA。8.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列是含有双链区域的siRNA或者shRNA，其中双链区域的第一部分包括与HIV共受体序列的一部分相同的序列，并且其中双链区域的第二部分包括与HIV共受体序列的另一部分互补的序列。9.如权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述HIV共受体为CCR5或CXCR4。10.如权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述shRNA含有序列SEQIDNO:25。11.如权利要求8所述的表达载体，其特征在于，当载体在宿主细胞中加以表达时，所述HIV共受体的抑制剂能够减少HIV共受体的表达。12.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述HIV融合抑制蛋白是C46蛋白质。13.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述HIV融合抑制蛋白含有序列SEQIDNO:26。14.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抑制HIV复制的蛋白质选自人类TRIM5α、猴TRIM5α、嵌合TRIM5α、人类TRIM5-亲环蛋白的融合蛋白、亲环蛋白、E3泛素、APOBEC3G和骨髓间基质细胞抗原2(BST-2)组成的组。15.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少两种其他的核酸序列包括(a)编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列；以及(b)编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列或者编码HIV复制抑制剂的核酸序列中的一种。16.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少两种其他的核酸序列包括编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列以及编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列。17.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少两种其他的核酸序列包括编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列以及编码HIV复制抑制剂的核酸序列。18.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括用来编码转录基因沉默元件的至少两种核酸。19.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括用来编码转录基因沉默元件的三种核酸。20.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为病毒载体。21.如权利要求20所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。22.如权利要求21所述的表达载体，其特征在于，所述慢病毒载体是自我失活型。23.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，当在宿主细胞中加以表达时，所述表达载体通过(1)X4-和R5-嗜性HIV病毒株，(2)高效抗逆转录病毒疗法(HAART)耐药HIV病毒株或(3)X4-和R5-嗜性抗HAART的HIV病毒株，赋予抵抗感染的能力。24.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述每个核酸都由单独的启动子来表达。25.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述至少两个核酸由同一启动子表达。26.一种表达载体，包括编码能够减少HIV共受体表达的抑制性核酸的第一核酸序列；编码HIV融合抑制蛋白的第二核酸序列和编码沉默核酸，将HIV的5′LTR的序列作为目标的第三核酸序列，其中所述第三核酸选自由以下组成的组：(i)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约143到位置约161的序列作为目标，(ii)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约136到位置约154的序列作为目标，(iii)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约205到位置约223的序列作为目标，以及(iv)沉默核酸，将HIV-1的5′LTR从位置约350到位置约368的序列作为目标。27.如权利要求26所述的表达载体，其特征在于，所述第一核酸序列可操作地连接到第一启动子；所述第二核酸序列可操作地连接到第二启动子以及所述第三核酸序列可操作地连接到第三启动子。28.如权利要求27所述的表达载体，其特征在于，所述第一、第二和第三启动子中至少有两个是相同的。29.如权利要求27所述的表达载体，其特征在于，所述第一、第二和第三启动子是不同的。30.如权利要求26所述的表达载体，还包括第四核酸，其特征在于，所述第四核酸选自由以下组成的组：将HIV的5′LTR的序列作为目标的另外的核酸，编码HIV复制抑制剂的核酸序列以及编码病毒进入的抑制剂的核酸序列；其中所述第四核酸可操作地连接到第四启动子。31.如权利要求26所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括至少两种沉默核酸，将HIV的5′LTR的序列作为目标。32.一种宿主细胞，包含如权利要求1-31中任一所述的表达载体。33.如权利要求32所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是造血祖细胞/干细胞、单核细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或树突状细胞。34.一种组合物，包含如权利要求1-31中任一所述的任一表达载体。35.如权利要求34所述的组合物，还包括药学上可接受的载剂。36.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述组合物被配制成乳状液。37.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述组合物与胶束或纳米颗粒配制。38.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述组合物被封装在聚合物中。39.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述组合物被封装在脂质体内。40.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述组合物被封装在微型细胞、纳米颗粒或纳米胶囊中。41.一种抑制HIV基因在受HIV感染的细胞中转录或复制的方法，包括用有效量的如权利要求1-31中任一所述的表达载体或如权利要求34-40中任一所述的组合物与所述细胞接触。42.一种治疗受试者中HIV感染的方法，包括对受试者施用有效量的如权利要求1-31中任一所述的表达载体或如权利要求34-40中任一所述的组合物。43.一种预防或减少受试者中HIV感染的方法，包括对受试者施用有效量的如权利要求1-31中任一所述的表达载体或如权利要求34-40中任一所述的组合物。44.一种预防或减少没有感染HIV的受试者生产性HIV感染的方法，包括对受试者施用有效量的如权利要求1-31中任一所述的表达载体或如权利要求34-40中任一所述的组合物。45.一种组合物，包括(i)包括至少两种核酸的表达载体，其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组：编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列；编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列；编码HIV复制抑制剂的核酸序列以及编码病毒进入抑制剂的核酸序列；和(ii)编码至少一种将HIV-1的5′LTR中的序列作为目标的转录基因沉默元件的核酸序列。46.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体和包括编码抑制HIV共受体的核酸分子的核酸序列和编码HIV融合抑制蛋白的核酸序列。47.如权利要求46所述的组合物，其特征在于，所述HIV共受体为CCR5和所述HIV融合抑制蛋白为C46。48.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述编码至少一种转录基因沉默元件的核酸选自由以下组成的组：(i)沉默核酸，将序列SEQIDNO:1作为目标，(ii)沉默核酸，将序列SEQIDNO:9作为目标，(iii)沉默核酸，将序列SEQIDNO:17作为目标，(iv)沉默核酸，将序列SEQIDNO:36作为目标，(v)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:1有至少95％同一性的序列作为目标，(vi)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:9有至少95％同一性的序列作为目标，(vii)沉默核酸，将与序列SEQIDNO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·铃木，A·D·凯莱赫，G·P·西蒙兹，C·L·E·阿伦斯蒂尔，
申请(专利权)人：卡琳缪恩股份有限公司，卡琳缪恩澳大利亚私人有限公司，圣文森特医院悉尼有限公司，新南创新私人有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US