产生IPS细胞的方法技术

公开了诱导多潜能干细胞的方法和组合物。例如，在一些方面描述了使用报告基因产生诱导的多潜能干细胞的方法。此外，本发明专利技术提供了新型的重编程载体，其中使用了报告基因。

The method of producing IPS cells

Methods and compositions for inducing pluripotent stem cells are disclosed. For example, in some aspects, we describe the method of inducing pluripotent stem cells using reporter genes. In addition, the invention provides a new reprogramming carrier, in which the reporter gene is used.

【技术实现步骤摘要】
产生IPS细胞的方法本申请是申请号200980138340.8的专利申请的分案申请。专利技术背景本申请要求2008年8月12日提交的美国申请号61/088,054的优先权，该申请的全部内容无所放弃地通过引用方式特别并入本文。1.专利
本申请大体上涉及干细胞领域。更具体而言，本申请涉及体细胞的重编程(reprogramming)。2.相关技术描述一般而言，干细胞是未分化的细胞，其可以产生成熟的功能性细胞的演替。例如，造血干细胞可以产生任意的不同类型的末端分化的血液细胞。胚胎干(ES)细胞源自胚胎，其是多潜能的，因此具有发育成任意器官或组织类型，或至少潜在地发育成完整胚胎的能力。诱导的多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcell)，通常简称为iPS细胞或iPSC，是一类通过插入某些基因人工地从非多潜能细胞(通常为成年体细胞)衍生而来的多潜能干细胞。人们相信，在很多方面，诱导的多潜能干细胞与天然多潜能干细胞例如胚胎干细胞是相同的，例如在以下方面：某些干细胞基因和蛋白的表达、染色质甲基化的式样、加倍时间、胚状体(embryoidbody)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合体的形成以及潜能和分化能力，但是其与天然多潜能干细胞的相关性的完整程度仍待确定。IPS细胞首先于2006年从小鼠细胞中产生(Takahashi等人,2006)，于2007年从人类细胞中产生(Takahashi等人,2007；Yu等人,2007)。这在干细胞研究中被认为是重要的进展，因为这可以允许研究人员获得多潜能干细胞而不必争议性地使用胚胎，多潜能干细胞在研究中具有重要意义并且具有潜在的治疗性应用。但是，在这些诱导的多潜能干(iPS)细胞的研究的现阶段，产生iPS细胞的效率低下，这阻碍了iPS细胞在临床研究中的应用。因此，需要开发一种增强产生诱导的多潜能干细胞的效率的方法。专利技术概述本专利技术通过以改善的效率提供诱导的多潜能干细胞而克服了本领域中的主要缺陷。在第一个实施方式中，提供了用于产生诱导的多潜能干(iPS)细胞群体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得一个或多个重编程载体，每个载体包含表达盒，所述表达盒包含：(i)转录调节元件；(ii)与所述转录调节元件可操作地连接的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码重编程因子或报告分子；(iii)位于所述第一核苷酸序列的3’端的IRES；和(iv)编码重编程因子或报告分子的第二核苷酸序列，其位于所述IRES的3’端，从而所述第二核苷酸序列受到所述IRES的翻译控制，其中：(1)，如果所述第一核酸编码重编程因子，则所述第二核苷酸序列编码另一重编程因子或报告分子；和(2)如果所述第一核酸编码报告分子，则所述第二核苷酸序列编码重编程因子；(b)将所述重编程载体导入体细胞群体的细胞中；(c)培养所述细胞以扩展所述群体；(d)选择所述经扩展的群体的子代细胞，其中所述子代具有胚胎干细胞的一个或多个特征；和(e)培养所选择的子代细胞以提供iPS细胞群体。在一些方面，所述第一核苷酸序列编码重编程因子并且所述第二核苷酸序列编码报告分子，反之亦可，因此报告基因的同时表达辅助如下文描述的重编程细胞的选择。为了在同一转录调节元件下共表达多个重编程因子，表达盒可以包含第二IRES和位于第二IRES的3’端的第三核苷酸序列，从而所述第三核苷酸序列受到所述第二IRES的翻译控制。在一些实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列可以编码不同的重编程因子。在以上任意情况下，报告分子可由第一、第二或第三核苷酸序列编码以改善转染和iPS细胞选择效率。本专利技术的能力部分依赖于报告分子的表达，例如荧光蛋白，其作为感染效率的指示，一般与来自同一多顺反子转录本的重编程基因的表达水平相关联，一旦细胞被完全诱导为多潜能，则所述报告分子即沉默。例如，上述方法的步骤c)可以进一步包括选择体细胞的群体，其中所述体细胞表达报告分子，并且培养所选细胞以扩展该群体。因此，在一些方面，可以使用荧光辅助的细胞分选法(FACs)基于报告分子例如荧光蛋白的表达水平来选择被感染(从最低效率感染至最高效率感染)的细胞。在示例性的实施方式中，报告分子可以是细胞表面标志物、荧光蛋白、表位、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶或β-半乳糖苷酶。例如，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或黄色荧光蛋白(YFP)，或其变体。取决于所用的报告分子，步骤c)中的选择可以包括荧光激活的细胞分选(FACS)、CAT测定、发光测定或本领域普通技术人员已知的任何用于检测或筛选报告分子表达的方法，以选择有效转染的细胞。替代性的或互补性的方法是，使用常规方法例如RT-PCR、原位杂交、RNA阵列或杂交法(例如Northern印迹)测定子代细胞中外源性报告分子转录本的不存在。在本专利技术的进一步的实施方式中，一个或多个重编程载体中包含的任意核苷酸序列所编码的iPS重编程因子可以包括来自Sox家族的至少一个成员和来自Oct家族的至少一个成员。Sox和Oct被认为是指定ES细胞特征的转录调节层级的中心。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可以是Oct-4。另外的因子可以增强重编程效率，例如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；重编程因子的特定组可以是包含Sox-2、Oct-4、Nanog和任选的Lin-28的组；或包含Sox-2、Oct4、Klf和任选的c-Myc的组。在另一个实施方式中，载体可以是病毒载体，更具体而言可以是逆转录病毒载体，例如鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)、Akv-MLV、SL-3-3-MLV或其它密切相关的病毒。病毒载体还可以是慢病毒载体。在一些方面，转录调节元件可以包含长末端重复区(LTR)以介导病毒基因的整合。在一些实施方式中，可以通过使用一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)来使用多顺反子转录本。示例性的IRES可以是脑心肌炎病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄病病毒IRES、甲肝病毒IRES、丙肝病毒IRES、人类鼻病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES、猪水疱病病毒IRES、芜菁花叶马铃薯Y病毒属病毒IRES、人类成纤维细胞生长因子2mRNAIRES、瘟病毒属IRES、利什曼原虫RNA病毒IRES、莫洛尼氏鼠白血病病毒IRES、人类鼻病毒14IRES、口蹄疫病毒IRES、人类免疫球蛋白重链结合蛋白mRNAIRES、果蝇触角足基因(Antennapedia)mRNAIRES、人类成纤维细胞生长因子2mRNAIRES、庚型肝炎病毒IRES、烟草花叶病毒属IRES、血管内皮生长因子mRNAIRES、柯萨奇B组病毒IRES、c-myc原癌基因mRNAIRES、人类MYT2mRNAIRES、人类双埃可病毒属1型病毒IRES、人类双埃可病毒属2型病毒IRES、真核启动因子4GImRNAIRES、Plautiastali肠道病毒IRES、泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒IRES、牛肠道病毒IRES、连接蛋白43mRNAIRES、同源域蛋白GtxmRNAIRES、AML1转录因子mRNAIRES、NF-κB阻抑因子mRNAIRES、X-连本文档来自技高网...

【技术保护点】
重编程载体，其包含多顺反子表达盒，其中所述多顺反子表达盒包含转录调节元件；和与所述转录调节元件可操作地连接的第一和第二编码序列，其中所述第一编码序列编码第一重编程因子并且所述第二编码序列编码第二重编程因子，其中所述重编程载体是基于Epstein‑Barr病毒(EBV)的载体，并且其中进一步地所述第一和第二重编程因子选自Sox、Oct、Nanog、Lin28、Klf4和c‑Myc。

【技术特征摘要】
2008.08.12 US 61/088,0541.重编程载体，其包含多顺反子表达盒，其中所述多顺反子表达盒包含转录调节元件；和与所述转录调节元件可操作地连接的第一和第二编码序列，其中所述第一编码序列编码第一重编程因子并且所述第二编码序列编码第二重编程因子，其中所述重编程载体是基于Epstein-Barr病毒(EBV)的载体，并且其中进一步地所述第一和第二重编程因子选自Sox、Oct、Nanog、Lin28、Klf4和c-Myc。2.权利要求1的重编程载体，其中所述表达盒还包含与所述转录调节元件可操作地连接的第三编码序列，其中所述第三编码序列编码重编程因子、报告分子或选择标志物。3.权利要求2的重编程载体，其中所述第三编码序列编码选择标志物。4.权利要求3的重编程载体，其中所述选择标志物是抗生素抗性标志物。5.权利要求2的重编程载体，其中所述报告分子是细胞表面标志物、荧光蛋白、表位、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶或β-半乳糖苷酶。6.权利要求5的重编程载体，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。7.权利要求1的重编程载体，其中Sox是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18。8.权利要求1的重编程载体，其中Oct是Oct-4。9.权利要求1的重编程载体，其中所述第一或第二重编程因子是Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc。10.权利要求1的重编程载体，其中所述表达盒还包含一个或多个IRES。11.权利要求10的重编程载体，其中所述IRES选自：脑心肌炎病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄病病毒IRES、甲肝病毒IRES、丙肝病毒IRES、人类鼻病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES、猪水疱病病毒IRES、芜菁花叶马铃薯Y病毒属病毒IRES、人类成纤维细胞生长因子2mRNAIRES、瘟病毒属IRES、利什曼原虫RNA病毒IRES、莫洛尼氏鼠白血病病毒IRES、人类鼻病毒14IRES、口蹄疫病毒IRES、人类免疫球蛋白重链结合蛋白mRNAIRES、果蝇触角足基因mRNAIRES、人类成纤维细胞生长因子2mRNAIRES、庚型肝炎病毒IRES、烟草花叶病毒属IRES、血管内皮生长因子mRNAIRES、柯萨奇B组病毒IRES、c-myc原癌基因mRNAIRES、人类MYT2mRNAIRES、人类双埃可病毒属1型病毒IRES、人类双埃可病毒属2型病毒IRES、真核启动因子4GImRNAIRES、Plautiastali肠道病毒IRES、泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒IRES、牛肠道病毒IRES、连接蛋白43mRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·梅克，
申请(专利权)人：细胞动力国际有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US