使用化学品的游离重编程制造技术

公开了用于诱导多能干细胞的方法和组合物。例如，在一些方面，描述了使用细胞信号传导调节子产生基本上不含载体的诱导的多能干细胞的方法。此外，本发明专利技术的一些方面提供了包含基本上不含异源逆转录病毒载体元件的诱导的多能干细胞、存在包含信号传导抑制剂的培养基的新的组合物。在一些方面，可以提供无饲养物的游离重编程方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用化学品的游离重编程
技术介绍
本申请要求2009年11月4日提交的美国临时申请号61/258，120的优先权权益， 其全部内容通过引用方式并入本文。1.专利
本专利技术总体上涉及干细胞发育的领域。更具体地，其涉及多能干细胞的产生。2.相关领域描述人胚胎干(ES)细胞的无限增殖能力和多能潜力已经提供了对于人体的所有细胞类型的空前的可获得性。具有需要的遗传背景的、直接源自患者体细胞的人诱导的多能干 (iPS)细胞具有人ES细胞的这两项重要特性，这使得这些细胞成为疾病模型、药物筛选、毒性测试和移植治疗的优良候选物。最初的人iPS细胞的衍生利用了基因组整合型逆转录病毒或慢病毒载体以递送重编程转基因(Lowry等人，2008;Park等人，2008 ； Takahashi 等人，2007; Yu等人，2007)。此类载体可能产生插入突变和残余转基因表达，插入突变会干扰人iPS细胞及其衍生物的正常功能，残余转基因表达会影响向特定谱系的分化( 等人，2007)，或甚至导致肿瘤形成(Okita等人，2007)。已经使用重复的质粒转染从小鼠胚胎成纤维细胞(Okita等人，2008)、使用非整合型腺病毒载体从小鼠肝细胞和人成纤维细胞(Stadtfeld等人，2008 Jhou and Freed, 2009)、使用附连的(piggyback)转座子从体细胞(Woltjen等人，2009)、使用基于 oriP/ΕΒΝΑ-Ι的游离载体从人成纤维细胞(Yu等人，2009)和蛋白质转导衍生了不含异源遗传元件的iPS细胞。虽然有这些迅速的进展，但是仍然存在大的障碍，阻止了产生高质量的不含异源遗传元件的人iPS细胞的任何单一技术的广泛应用。例如，所有目前的允许产生不含异源遗传元件的人iPS细胞的技术(除了附连的转位子方法以外)都具有非常低的重编程效率。这种低效率使得难以从多种可容易获得的人类体细胞类型持续获得、以及从具有不同遗传背景和供体年龄的细胞持续获得iPS细胞。附连的转位子方法提供了适宜的重编程效率。然而，当涉及很多供体细胞系时，从iPS细胞中除掉转位子会是相当费力的。此外，虽然人iPS细胞与人ES细胞有高度相似性，但是，在人iPS细胞的基因表达 /表观遗传学修饰和谱系特异性分化潜力上存在显著的克隆与克隆间的差异。特别地，与人 ES细胞相比，多数人iPS细胞显示出显著较低的神经分化潜力，并且对于LIF (白血病抑制因子)无应答，LIF常规地支持小鼠ES细胞培养。此外，由于缺乏针对高质量人iPS细胞的良好的容易检验的标志物，高质量的人iPS细胞克隆的选择可能是费时费力的。人类体细胞遗传重编程为诱导的多能干细胞(iPSC)可以提供用于移植治疗的可更新的细胞来源。为了实现它们的前途，理想的是，在不含饲养细胞、不含异源DNA(无印迹)的化学上确定的培养基中衍生并培养人iPSC。目前，没有用于产生无印迹的人iPSC的简单和有效的无饲养物的非病毒方法。之前的通过使用游离载体递送转基因而产生无印迹的人iPSC的尝试是低效率的，并且需要饲养细胞。因此，需要解决在制备基本上不含异源遗传成分的诱导的多能干细胞时的效率低下的问题或其它问题。
技术实现思路
本专利技术的方面通过提供用于制备基本上不含异源载体元件的诱导的多能干细胞的新方法而客服了本领域中的主要缺陷，并由此提供了 iPS细胞应用上的特别优点。另外，使用小分子，本专利技术的某些示例性方面大大改进了游离重编程效率(>70 倍；如果使用转化缺陷型MYC例如LMYC，则>300倍)，并使用化学上确定的培养基建立了无饲养物的重编程条件，用于衍生无印迹的人iPSC。这些改进使得能够从皮肤成纤维细胞以及很多其它细胞类型常规衍生无痕迹的人iPSC，因此使得该技术容易地适用于临床级别的人iPSC的生产。因此，在第一个实施方式中，提供了包含iPS细胞的群体和培养基的组合物，所述 iPS细胞基本上不含异源逆转录病毒元件，所述培养基包含外部添加的信号传导抑制剂。在一些方面，这些iPS细胞可以实质上不含，或优选地，基本上不含异源载体或遗传元件。例如，这些iPS细胞可以衍生自一种或多种人类细胞。在另一个方面，该群体的细胞可以包含选择的人类个体例如人类患者的基因组。在一些方面，所述人类细胞是原代人类细胞，其是从活体人类受试者直接获得的细胞，并且可以排除建立的或永生化的细胞系的使用。一些实施方式可以包括使用末端分化的人类细胞。原代人类细胞的非限制性实例包括成纤维细胞、角化细胞、造血细胞、间充质细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、肝细胞、肾细胞、皮肤细胞、消化道细胞、卵丘细胞、腺细胞或胰岛细胞。更具体地，原代人类细胞可以是造血祖细胞，例如 CD34+细胞。原代人类细胞可以获自血液样品、毛发样品、皮肤样品或本领域普通技术人员已知的任何来源。所述信号传导抑制剂可以是选自下列的一种或多种糖原合酶激酶3(GSK_3)抑制剂，有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂，转化生长因子β (TGF-β)受体抑制剂，白血病抑制因子(LIF)，以及它们的组合。特别地，所述组合物包含细胞群体和下列的组合GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂和可选地LIF。所述培养基可以进一步包含外部添加的ROCK抑制剂或肌球蛋白II抑制剂。所述ROCK抑制剂可以是ΗΑ-100。所述培养基可以进一步包含外部添加的FGF。在一些方面，所述组合物可以进一步包含化学上确定的培养基。化学上确定的培养基的非限制性实例包括^TeSR培养基、人胚胎细胞培养基、Ν2Β27培养基以及它们的衍生物。所述组合物还可以包含基质成分以替代饲养细胞，以支持细胞群体的培养。用于细胞粘附的基质成分可以是任何用于使干细胞或饲养细胞(如果使用)附着的物质。基质成分的非限制性实例包括胶原、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白以及它们的混合物，例如，Matrigel 和裂解的细胞膜制剂。在一些实施方式中，本专利技术涉及用于产生iPS细胞群体的方法，包括a)获得包含表达一种或多种重编程因子的染色体外遗传元件的体细胞；和b)在重编程条件下培养所述体细胞和/或其子代细胞，所述重编程条件包括外部添加的一种或多种信号传导抑制剂，例如GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、和/或TGF- β受体抑制剂，从而产生iPS细胞的群体。 在一些方面，重编程培养基可以包含下列的组合631(-3抑制剂、1^1(抑制剂36 -0受体抑制剂和可选地LIF。在其它方面，重编程条件可以基本上不含饲养细胞，例如经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞。重编程条件可以包括基质成分，例如Matrigel 。所述体细胞可以是人类细胞或原代细胞，例如原代人细胞。体细胞的实例可以包括但不限于成纤维细胞、角化细胞、造血细胞、间充质细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、肝细胞、肾细胞、皮肤细胞、消化道细胞、卵丘细胞、腺细胞、胰岛细胞。造血细胞可以包括任何血液细胞，例如造血祖细胞(例如⑶34+细胞)、T细胞、B细胞， 或它们的组合。在一些方面，所述染色体外遗传元件可以进一步定义为游离载体。例如，游离载体可以包括复制起始点和一种或多种用于表达重编程因子的表达盒。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·于，
申请(专利权)人：细胞动力国际有限公司，
类型：发明
国别省市：