检测融合基因MLL/CBP的表达情况及融合型别的寡核苷酸及应用制造技术

本发明专利技术为检测融合基因MLL/CBP的表达情况及融合型别的寡核苷酸及应用。先采用含有三种型别引物的多重引物荧光PCR进行初检。若出现阳性，再用特异性引物荧光PCR进行具体型别鉴定，这样即降低了初检成本，又提高了检测通量。本发明专利技术所述试剂盒特异性好，灵敏度高，通量大，适用于大批量样本检测。对于白血病诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

Detection of fusion gene MLL/CBP expression and fusion type oligonucleotides and their application

The invention is to detect the expression of fusion gene MLL/CBP and the oligonucleotide of fusion type and its application. Primers were first detected by multiplex primer PCR containing three types of primers. If positive, specific primer fluorescent PCR was used for specific typing, which reduced the cost of initial detection and increased the throughput of detection. The kit has good specificity, high sensitivity and large flux, and is suitable for large batch sample detection. It is of great significance for leukemia diagnosis, adjustment of therapeutic regimen, evaluation of therapeutic effect, prognosis prediction and prevention of clinical relapse.

【技术实现步骤摘要】
检测融合基因MLL/CBP的表达情况及融合型别的寡核苷酸及应用
本专利技术属生命科学和生物
，具体涉及一种筛查用途的白血病融合基因MLL/CBP检测的引物、探针和检测试剂盒。
技术介绍
随着化疗、放疗以及生物基因疗法在治疗恶性肿瘤中的广泛应用，使大部分恶性肿瘤得以有效治疗和控制，甚至部分获得治愈。但由于化、放疗在治疗的同时亦会损伤正常造血干细胞及免疫细胞，导致基因突变，从而诱发治疗相关性白血病(therapy-relatedleukemia)。治疗相关性白血病是一种综合症，具有原发性白血病的各种临床表现，主要发生于初发癌(血液恶性肿瘤、实体癌)治疗后，大约占各类白血病的7％。此外，治疗相关性白血病普遍存在潜伏期长，对治疗反应差，生存期短的临床特症，严重危害着肿瘤患者的生存。混合谱系白血病(Mixed-lineageleukemia,MLL)基因与其融合伙伴因染色体易位而产生的融合基因是治疗相关性白血病中的常见类型，具有恶性程度高，对化疗不敏感，缓解率低的特点。其中共活化集合蛋白基因(CREB,bingdingprotein，CBP)与MLL结合产生的融合基因MLL-CBP(t11；16)(q23；p13)是一种罕见的融合基因类型，主要有MLLexon8/CBPexon3、MLLexon9/CBPexon3和MLLexon10/CBPexon3。研究表明MLL-CBP融合蛋白能够引发骨髓增生和加强粒性白细胞与巨噬白细胞前体自我更新和增殖能力，而这些异常现象则可能进一步发展为白血病。经临床案例分析，MLL-CBP被证实与治疗相关性急性粒单核白血病(therapy-relatedacutemyelomonocyticleukemia,t-AMML)、慢性粒单核细胞白血病(therapy-relatedchronicmyelomonocyticleukemia,t-CMML)等具有密切联系，且常伴有高发性的骨髓异常增生综合症(therapy-relatedmyelodysplasticsyndrome,t-MDS)。实时荧光PCR综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在封闭状态下的PCR反应管中进行，其结果用Ct值表示，与普通PCR比较，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点。实时荧光PCR中常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性，而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此，本试剂盒采用实时荧光PCR中的Taqman探针法检测融合基因MLL/CBP以及对其型别进行鉴定。
技术实现思路
本专利技术设计了检测内参/目的基因用引物、探针，采用实时荧光PCR，检测内参基因ABL、目的基因MLL/CBP的表达情况，鉴定MLL/CBP融合型别。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。用于MLL/CBP的检验试剂盒中含有红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit(TOYOBO公司)、检测体系PCR反应液1、检测体系PCR反应液2、检测体系PCR反应液3、检测体系PCR反应液4、阳性对照品1、阳性对照品2、阳性对照品3、阳性对照品4、阴性对照品和内参ABLPCR反应液，其特征在于：检测体系PCR反应液1包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)、检测目的基因用上下游引物分别为：MLL/CBP-8-F、MLL/CBP-8-R、MLL/CBP-9-F、MLL/CBP-10-F、MLL/CBP-9-10-R，探针为MLL/CBP-Probe，用于初检是否存在MLL/CBP融合。探针、引物序列如下，MLL/CBP-8-F:CCGCCCAAGTATCCCTGTAAMLL/CBP-8-R:ATTTGGCACGTTGGTGACTGMLL/CBP-9-F:CCAATGGCAATAGTTCTAAGCAAMLL/CBP-10-F:GGCAGTAGTGGGCATGTAGAGATMLL/CBP-9-10-R:CTGTAGGGAAGGTGGGCAAMLL/CBP-Probe:FAM-AGCCAGCAAACAGAGCATGGTCAACA–TAMRA检测体系PCR反应液2包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)，用于鉴别MLL/CBP-8的引物MLL/CBP-8-F、MLL/CBP-8-R以及探针MLL/CBP-Probe。探针、引物序列如下，MLL/CBP-8-F:CCGCCCAAGTATCCCTGTAAMLL/CBP-8-R:ATTTGGCACGTTGGTGACTGMLL/CBP-Probe:FAM-AGCCAGCAAACAGAGCATGGTCAACA–TAMRA检测体系PCR反应液3包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)，用于鉴别MLL/CBP-9的引物MLL/CBP-9-F、MLL/CBP-9-10-R以及探针MLL/CBP-Probe。探针、引物序列如下，MLL/CBP-9-F:CCAATGGCAATAGTTCTAAGCAAMLL/CBP-9-10-R:CTGTAGGGAAGGTGGGCAAMLL/CBP-Probe:FAM-AGCCAGCAAACAGAGCATGGTCAACA–TAMRA检测体系PCR反应液4包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)，用于鉴别MLL/CBP-10的引物MLL/CBP-10-F、MLL/CBP-9-10-R以及探针MLL/CBP-Probe。探针、引物序列如下，MLL/CBP-10-F:GGCAGTAGTGGGCATGTAGAGATMLL/CBP-9-10-R:CTGTAGGGAAGGTGGGCAAMLL/CBP-Probe:FAM-AGCCAGCAAACAGAGCATGGTCAACA–TAMRA内参ABLPCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)，检测ABL的引物ABL-F、ABL-R以及探针ABL-Probe。探针引物序列如下，ABL-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAABL-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAABL-Probe:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA此外，所述阴性对照品为无MLL/CBP融合基因的溶液。所述阳性对照品1为含MLL/CBP-8、MLL/CBP-9、MLL/CBP-10融合基因质粒溶液；阳性对照品2为MLL/CBP-8融合基因质粒溶液；阳性对照品3为MLL/CBP-9融合基因质粒溶液；阳性对照品4分别为MLL/CBP-10融合基因质粒溶液。本专利技术的设计思路为：1.引物、探针设计针对MLL/CBP融合概率较高的MLLexon8/CBPexon3、MLLexon9/CBPexon3和MLLexon10/CBPexon3设计引物和探针。依据MLLexon8、exon9、exon10序列设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测融合基因MLL/CBP的表达情况及融合型别的寡核苷酸，其特征在于，包括引物MLL/CBP‑8‑F、MLL/CBP‑8‑R、MLL/CBP‑9‑F、MLL/CBP‑10‑F、MLL/CBP‑9‑10‑R和探针为MLL/CBP‑Probe，所述引物和探针序列如下：MLL/CBP‑8‑F:CCGCCCAAGTATCCCTGTAAMLL/CBP‑8‑R:ATTTGGCACGTTGGTGACTGMLL/CBP‑9‑F:CCAATGGCAATAGTTCTAAGCAAMLL/CBP‑10‑F:GGCAGTAGTGGGCATGTAGAGATMLL/CBP‑9‑10‑R:CTGTAGGGAAGGTGGGCAAMLL/CBP‑Probe:FAM‑AGCCAGCAAACAGAGCATGGTCAACA–TAMRA。

【技术特征摘要】
1.检测融合基因MLL/CBP的表达情况及融合型别的寡核苷酸，其特征在于，包括引物MLL/CBP-8-F、MLL/CBP-8-R、MLL/CBP-9-F、MLL/CBP-10-F、MLL/CBP-9-10-R和探针为MLL/CBP-Probe，所述引物和探针序列如下：MLL/CBP-8-F:CCGCCCAAGTATCCCTGTAAMLL/CBP-8-R:ATTTGGCACGTTGGTGACTGMLL/CBP-9-F:CCAATGGCAATAGTTCTAAGCAAMLL/CBP-10-F:GGCAGTAGTGGGCATGTAGAGATMLL/CBP-9-10-R:CTGTAGGGAAGGTGGGCAAMLL/CBP-Probe:FAM-AGCCAGCAAACAGAGCATGGTCAACA–TAMRA。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，用于鉴别MLL/CBP-8的引物MLL/CBP-8-F、MLL/CBP-8-R以及探针MLL/CBP-Probe；MLL/CBP-9的引物MLL/CBP-9-F、MLL/CBP-9-10-R以及探针MLL/CBP-Probe；用于鉴别MLL/CBP-10的引物MLL/CBP-10-F、MLL/CBP-9-10-R以及探针MLL/CBP-Probe。3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，还包括用于内参基因ABL检测的引物ABL-F、ABL-R以及探针ABL-Probe，所述引物和探针序列为：ABL-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAABL-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAABL-Probe:FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。4.检测融合基因MLL/CBP的表达情况及融合型别的寡核苷酸的试剂盒，其特征在于，包括引物MLL/CBP-8-F、MLL/CBP-8-R、MLL/CBP-9-F、MLL/CBP-10-F、MLL/CBP-9-10-R和探针为MLL/CBP-Probe，所述引物和探针序列如下：MLL/CBP-8-F:CCGCCCAAGTATCCCTGTAAMLL/CBP-8-R:ATTTGGCACGTTGGTGACTGMLL/CBP-9-F:CCAATGGCAATAGTTCTAAGCAAMLL/CBP-10-F:GGCAGTAGTGGGCATGTAGAGATMLL/CBP-9-10-R:CTGTAGGGAAGGTGGGCAAMLL/CBP-Probe:FAM-AGCCAGCAAACAGAGCATGGTCAACA–TAMRA。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还含有红细胞裂解液。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品。7.一种降低融合基因MLL/CBP检测成本的方法，包括以下步骤：(1)抽提血液样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴鹏飞，黄开新，王淑一，
申请(专利权)人：济南艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37