本发明专利技术公开了高度降解样本中植物性DNA的检测引物，该检测引物共有3个引物对且在检测过程中同时使用，分别为100碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；70碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；50碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；本发明专利技术提供的引物组合具有高通用性，在实验中具有高稳定性，应用该引物可快速检测植物DNA样本的可扩增性和降解程度，为样品设计PCR扩增长度等提供参考，具有广泛的应用前景。
Primers for detection of plant DNA in highly degraded samples
The present invention discloses 3 primers for detection of plant DNA in highly degraded samples. The primers have 3 primers pairs and are used simultaneously in the detection process. The primer pairs are 100 base primers pairs, respectively, such as SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2, and the sequence of 70 base primers, such as SEQ ID ID NO:3 and SEQ ID, 50. The sequence of primer pairs, such as SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO:6, shows high throughput and high stability in the experiment. The primer can quickly detect the scalability and degree of degradation of plant DNA samples, and provide a reference for the sample design of PCR amplification length and so on. Application prospect.
【技术实现步骤摘要】
高度降解样本中植物性DNA的检测引物
本专利技术属于分子生物学和基因组学实验
，主要针对高度降解植物样品中DNA降解程度和PCR可扩增性的快速检测。
技术介绍
DNA是分子生物学和基因组学研究工作的起点，按标准采集材料获取高质量的DNA是这些工作的理想条件，但在很多实际工作中，不得不面对使用低质量DNA开展工作。如馆藏植物腊叶标本，对许多难以采集的物种，是一个巨大的潜在遗传信息来源库；实际工作中往往需要鉴定诸如经炮制的中草药，环境、土壤中的植物样本，甚至动物消化物中植物来源等高度降解的植物DNA样品。目前，针对这些样品的DNA提取和遗传信息的获取是本领域的热点之一。这些高度降解的样品中DNA非常微量并且高度降解，往往只有皮克级长度在100碱基对以下的碎片，一般的凝胶和紫外检测设备无法直接检测到。
技术实现思路
针对现有技术难以检测到高度降解样本中植物性DNA的问题，本专利技术提供了一组用于高度降解样本中植物性DNA的检测引物，本专利技术利用PCR扩增的高度灵敏性和多重PCR技术的高效性，设计筛选出50碱基对、70碱基对和100碱基对长度的植物高通用扩增引物，通过三重PCR扩增和凝胶检测技术，检测低质量样本中DNA的降解程度和PCR的可扩增性，为这类样品的分子标记检测和遗传信息获取提供前期预测。本专利技术通过对200多科270属2000多种已有维管植物叶绿体基因组的比较分析，在其共有保守区设计筛选出扩增长度为50碱基对、70碱基对和100碱基对的3对引物，使用多重PCR技术，通过对46个代表性样品和43个标本材料进行了3对引物在一个反应中同时扩增的检测实验，结果验证了引物组合的高通用性，和实验体系的高稳定性。运用该实验体系，可快速检测植物DNA样本的可扩增性和降解程度，为样品设计PCR扩增长度提供参考。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：植物高通用引物+多重PCR反应体系+琼脂糖凝胶电泳检测方法；1、植物高通用引物的设计筛选基于植物特有的叶绿体基因组，在对已有200多科270属2000多种已有维管植物叶绿体基因组的比较分析，使用Premier6.0软件进行引物开发，在其共有保守区设计筛选扩增长度为50碱基对、70碱基对和100碱基对的3对引物，其设计尽量考虑各引物的退火温度一致（52℃）和控制引物二聚体的形成；并经46份不同科植物材料验证其高通用性；上述用于多重PCR的引物序列分别为：100碱基引物对psb_F：5'-AGCAGTCCAAGGGGTTGGTT-3'，psb_R：5'-AGCAAAAACATCTCTGAACAAGGTTCT-3'；70碱基引物对16S_F：5'-CGTTGAGTTTGGAACCCTGAAC-3'，16S_R：5'-ACTTGACGTCATCCTCACCTTC-3'；50碱基引物对4.5S_F：5'-GTGGAAGTGCAGTGATGTATGC-3'，4.5S_R：5'-GTCTACCGGTCTGTTAGGATGC-3'；2、建立针对植物DNA样本的多重PCR的反应体系和反应程序多重PCR的反应体系为：DNA模板2μl、2×TaqPCRMasterMix(TIANGEN公司)11μl、混合引物(5μm)1μl、ddH2O8μl；多重PCR的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸35s，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃，保存；3、PCR扩增产物的检测多重PCR的检测方法，取PCR扩增产物5μL，Mark3μL，在4.5%琼脂糖凝胶(含4SGreenplus核酸染色剂)中电泳；电压为140V，电流为60mA，电泳时间80min。使用多重PCR技术，通过对46个代表性样品和43个标本材料进行3对引物在一个反应中同时扩增的检测实验，验证引物组合的高通用性和实验体系的高稳定性；所述46个代表性样品来自中国西南野生生物种质资源库，材料为近5年采集，经变色硅胶干燥后保存于密封盒中，密封盒存放在分子材料库内，库环境温度稳定在15℃，湿度稳定在15%RH；46份植物材料代表分类学上不同的科，经多重PCR电泳检测结果显示，所有材料均扩增成功，显示3条亮带，表明3对检测引物具有很高的通用性。所述43个植物标本材料中25份来自中科院昆明植物研究所标本馆，材料为采集时间15年以上腊叶标本，存放环境为常温，空调具一定的除湿功能，定期杀虫，与外界相对隔离。经多重PCR电泳检测结果显示，PCR扩增均成功出现3条亮带的材料13份（引物分别为4.5S_F/R、16S_F/R和psb_F/R，对应条带大小为50碱基对、70碱基对和100碱基对）；PCR扩增出现2条亮带的材料10份（引物分别为4.5S_F/R和16S_F/R，对应条带大小为50碱基对和70碱基对）；PCR扩增出现1条亮带（引物4.5S_F/R，条带大小50碱基对）和无条带的材料各1份。以上结果表明大约52%的材料所提取的DNA大小在100碱基对以上；大约40%的材料其DNA大小在70碱基对可扩增，少数材料的DNA已降解为50碱基对及以下片段。另外18份材料来自中科院华南植物园标本馆，3份为当年采集制作的腊叶标本；15份为采集时间25年以上的腊叶标本，叶片碎裂发黑，失去韧性。上述18份来自中科院华南植物园标本馆的植物材料，经多重PCR电泳检测结果显示，3份当年采集制作的腊叶标本均扩增成功出现3条亮带（引物分别为4.5S_F/R、16S_F/R和psb_F/RF，对应条带大小为50碱基对、70碱基对和100碱基对）。15份采集时间25年以上的腊叶标本材料中，PCR扩增成功出现3条亮带的材料1份（引物分别为4.5S_F/R、16S_F/R和psb_F/RF，对应条带大小为50碱基对、70碱基对和100碱基对）；PCR扩增出现2条亮带的材料2份（引物分别为4.5S_F/R和16S_F/R，对应条带大小为50碱基对和70碱基对）；PCR扩增出现1条亮带（引物4.5S_F/R，条带大小50碱基对）和无条带的材料各6份。以上结果表明，3份当年采集制作的腊叶标本DNA扩增均获得成功，DNA大小在100碱基对或100碱基对以上；15份采集时间25年以上腊叶标本材料中，80%的材料DNA已降解为50碱基对及以下片段，只有20%的材料DNA在70碱基对可扩增。本专利技术的优点和技术效果：本专利技术设计了3对针对降解植物材料DNA的多重PCR扩增引物，以及提供了针对植物降解材料DNA的多重PCR扩增反应体系、反应程序和琼脂糖凝胶电泳检测的方法；与传统DNA质量检测相比，多重PCR检测灵敏度高，数据可靠，重复性强，同时本专利技术在电泳检测中提供了分子量梯度为10碱基对的DNAMarker和空白对照，提高了结果准确性，可以定量检测DNA降解程度，为降解植物材料的基因测序，物种鉴定等工作提供基础保障，具有广泛的应用前景；运用该实验体系，可快速检测植物DNA样本的可扩增性和降解程度，为样品设计PCR扩增长度提供参考。附图说明图1为用于植物高通用引物筛选的46份植物材料DNA中部分材料的多重PCR电泳图；图2为用于植物高通用引物筛选的46份植物材料DNA中部分材料的多重PCR电泳图；图3为来源于中科院昆明植物研究所标本馆馆藏25份植物材料DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
高度降解样本中植物性DNA的检测引物，其特征在于，该检测引物共有3个引物对且在检测过程中同时使用，分别为：100碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；70碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；50碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
【技术特征摘要】
1.高度降解样本中植物性DNA的检测引物，其特征在于，该检测引物共有3个引物对且在检测过程中同时使用，分别为：100碱基引物对，其序列如SEQIDNO：1和S...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊波，李洪涛，杨静，袁文斌，杨继雄，曾春霞，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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