质谱鉴定霍乱弧菌分型的方法及产品技术

本发明专利技术公开了一种利用飞行时间质谱技术快速鉴定霍乱弧菌的方法，主要包括如下步骤：使用特定引物组合对待测霍乱弧菌的特征片段进行多重PCR扩增；将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过质谱检测多重PCR产物的片段的大小；将质谱结果与霍乱弧菌指纹图谱库比较，以确定待检霍乱弧菌的具体分型。本发明专利技术还保护用于该方法中的质谱试剂盒。该方法可对环境卫生、食品安全检测、公共场所安全、进出口检验检疫等领域的霍乱弧菌分型进行鉴定，以维护公共卫生安全。

The method and product of identification of Vibrio cholerae by mass spectrometry

The present invention discloses a method for rapid identification of Vibrio cholerae by using time of flight mass spectrometry, which mainly includes the following steps: using specific primers to combine the characteristic fragments of Vibrio cholerae to multiply PCR amplification, and purify multiple PCR products through an adsorption column; On the crystal, the size of the fragments of multiple PCR products was detected by mass spectrometry; the results of mass spectrometry were compared with the fingerprint Library of Vibrio cholerae to determine the specific typing of Vibrio cholerae. The invention also protects the mass spectrogram kit used in the method. This method can be used to identify the subtypes of Vibrio cholerae in the fields of environmental hygiene, food safety inspection, public safety, import and export inspection and quarantine, in order to maintain public health safety.

【技术实现步骤摘要】
质谱鉴定霍乱弧菌分型的方法及产品
本专利技术属于分子生物学检测领域，涉及一种利用飞行时间质谱技术快速鉴定霍乱弧菌分型的方法及其产品。
技术介绍
霍乱是一种由霍乱弧菌(Vibriocholerae)引起的以腹泻为主要症状的烈性传染病，在我国被列为甲类传染病。霍乱弧菌进入消化道到达小肠，在肠黏膜表面吸附并迅速繁殖，产生的霍乱肠毒素作用于小肠黏膜，引起小肠液过度分泌。严重者出现上吐下泻，导致脱水和代谢性酸中毒、循环衰竭，甚至产生休克和死亡。除了临床上需要加强霍乱弧菌的检测之外，在食品安全(如肉制品加工、烧烤店)、环境卫生(如学校机关的后勤场所)、进出口检验检疫、公共场所安全方面也需要对霍乱弧菌进行分型鉴定，以维护公共卫生安全。研究发现霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，共分为139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。霍乱弧菌的致病因子主要有CTX基因元件(其中的ctx基因编码霍乱肠毒素)、TCP致病岛(编码TCP菌毛)和toxR(毒力调节基因，调控编码CT和TCP的基因)3种。霍乱肠毒素(choleratoxin，CT)也称霍乱毒素，是一种外毒素，具有很强的抗原性，而且霍乱毒素基因(ctx)的保守性相当高。为了预防霍乱的发生和流行，迅速采取措施，有效控制疫情的发展蔓延，霍乱弧菌的快速检测尤为重要。长期以来，对霍乱弧菌的鉴定都采用传统的微生物学检测方法，即形态学、生理生化特征及血清学鉴定。此方法虽然准确度高，但所需时间太长，最快也要十几个小时才能完成，难以适应快速检测的要求。以多重PCR为基础的核酸检测方法，对霍乱的早期诊断和传染源的发现具有重要意义。且多重PCR检测针对多个基因，假阴性率比单重PCR降低。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，简称MALDI-TOFMS)技术，是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术。其质量分析器是一个离子漂移管(iondirfttube)，由离子源产生的离子首先被收集，在收集器中所有离子速度变为0，使用一个脉冲电场加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比大小进行分离，准确检测多肽、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分子质量和纯度，具有准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高的优点。近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP)、插入/缺失(InDel)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copynumbervariation，CNV)等多种DNA变化类型进行检测。已有一些公开文献使用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A，“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-TOF鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-TOF鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-TOF鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐，适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。中国专利申请201110154723、“MALDITOFMS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDITOFMS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDITOFMS技术辅助鉴定细菌的方法，包括：预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDITOFMS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理(通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测)，尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。中国专利申请201210272533.6“建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品”，公开了一种基于质谱技术快速鉴定幽门螺杆菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。该方法利用飞行时间质谱技术，对分子量和丰度各异的核酸片段进行检测，并形成谱图。但是，该方法中核酸片段经PCR扩增后，还需经过SAP酶消化、转录和核酸酶切，仅能识别单个碱基的变化，无法检测有特征序列的长片段DNA。此外，基于MALDI-TOFMS，开发了一些核酸检测方法，如美国Agena公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOODassay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。各公司为了提高质谱仪的分辨率，对目标位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含单核苷酸多态性(SNP)位点的多重PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOODassay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。然而，以上方法，都不可避免地存在操作复杂，耗时长等问题。此外，美国Sampath等([J].PLoSOne，2007，2(5):e489)报道了将RT-PCR和电喷雾色谱相结合的技术(reversetranscriptionPCR/electrospray-ionizationmassspectrometry，RT-PCR/ESI-MS)。该方法可快速检测出92种哺乳类动物及禽类流感分离株，推断出30种不同的H及N型病毒(其中包括29种AIVH5N1分离株)，准确率高达97％，时间只要短短几小时。同时该技术可以检测混合感染的病毒样品且可用于病毒的各个亚型及未知核酸序列病毒新变异株的大规模检测。但该技术所需的质谱仪价格昂贵，目前还只局限于在少数的研究机构中使用。中国专利申请200880121570、专利技术名称“用于诊断和监测精神疾病的方法和生物标志物”报道了可以通过MALDI-TOF质谱技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质谱鉴定霍乱弧菌分型的方法，步骤包括使用特定引物组合对待测霍乱弧菌的特征片段进行多重PCR扩增；将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过质谱检测多重PCR产物的片段的大小；将质谱结果与霍乱弧菌指纹图谱库比较，以确定待检霍乱弧菌的具体分型；其中，所述引物为扩增霍乱弧菌的ctxA片段的特异性引物的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其扩增产物的质谱峰值为22115Da；扩增霍乱弧菌的ctxB片段的特异性引物的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，其扩增产物的质谱峰值为30010Da；扩增霍乱弧菌的ompW片段的特异性引物的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，其扩增产物的质谱峰值为34874Da。

【技术特征摘要】
1.一种质谱鉴定霍乱弧菌分型的方法，步骤包括使用特定引物组合对待测霍乱弧菌的特征片段进行多重PCR扩增；将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过质谱检测多重PCR产物的片段的大小；将质谱结果与霍乱弧菌指纹图谱库比较，以确定待检霍乱弧菌的具体分型；其中，所述引物为扩增霍乱弧菌的ctxA片段的特异性引物的SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，其扩增产物的质谱峰值为22115Da；扩增霍乱弧菌的ctxB片段的特异性引物的SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，其扩增产物的质谱峰值为30010Da；扩增霍乱弧菌的ompW片段的特异性引物的SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，其扩增产物的质谱峰值为34874Da。2.权利要求1的方法，其中所述霍乱弧菌为O1群和/或O139群。3.权利要求1或2的方法，其中所述PCR扩增的反应体系30μl中含有：4.权利要求3的方法，其中所述MALDI-TOFMS检测中所使用的点样基质的组成为，3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。5.权利要求1-4的方法，其中所述方法用于环境卫生、公共场所等领域的霍乱弧菌分型的鉴定。6.用于权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，钟逾，刘昕超，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11