针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系及应用制造技术

基于目前采用壳聚糖(CS)纳米粒的基因靶向输送技术的现状，本发明专利技术提供了针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系及其应用。所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸HAD共价交联到壳聚糖纳米粒CSNPs上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒。其中，所述壳聚糖纳米粒CSNPs为包裹siRNA的壳聚糖纳米粒，即CSNps‑siRNA。所述氧化透明质酸HAD中醛基的数目为2个。所述氧化透明质酸HAD采用醇相反应制备得到。本申请采用的醇相反应在室温下室温即可进行，不需要加热；而且透明质酸HA在乙醇溶液中处于溶胀状态，而非溶解态，所以浓度可以在5‑10％(w/v)，一次性反应量大大增加。

Targeting gene delivery system for CD44 high expression tumor and its application

Based on the current status of gene targeting delivery technology using chitosan (CS) nanoparticles, the present invention provides a gene targeting delivery system for CD44 high expression tumor and its application. The gene targeted delivery system is a conjugated chitosan targeting nanoparticle that is covalently linked to the chitosan nanoparticles CSNPs by a modified hyaluronic acid HAD with a dialdehyde base. The chitosan nanoparticles CSNPs are chitosan nanoparticles coated with siRNA, namely CSNps siRNA. The number of aldehyde groups in the oxidized hyaluronic acid HAD is 2. The oxidized hyaluronic acid HAD was prepared by alcohol phase reaction. The alcohol phase used in this application can be carried out at room temperature at room temperature without heating, and the hyaluronic acid HA is in the swelling state in the ethanol solution, not the dissolved state, so the concentration can be 5 to 10% (w/v), and the amount of one time reaction is greatly increased.

【技术实现步骤摘要】
针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系及应用
本专利技术属于医药领域，涉及基因载体，具体涉及采用改性透明质酸修饰壳聚糖纳米粒得到的靶向基因载体。
技术介绍
现代分子生物学研究表明，肿瘤的发生发展是多基因、多阶段、多步骤的复杂演进过程。其根本原因可能在细胞内部基因结构及表达的异常改变，涉及到多种原癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、细胞粘附因子及DNA修复基因等的异常和积累。如Bcl2为一原癌基因，也是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因之一。研究表明，Bcl2基因的易位和高表达与肿瘤的发生、发展及不良预后密切相关，降低或消除Bcl2基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除Bcl2对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。所以，基于分子水平的基因治疗是肿瘤治疗的一项重要策略。而这其中，选择肿瘤细胞特异的分子靶点进行有效治疗，不但可以取得明显疗效，而且避免伤害正常的细胞，因此该方法越来越被医学界所认同。RNA干扰(RNAi)技术是常用的有效基因技术，许多研究结果证实，运用siRNA分子可以阻断癌症细胞中重要蛋白的表达，阻止恶性表型的出现。因此，RNAi技术作为一种癌症治疗手段，具有巨大的应用潜力。然而，siRNA的治疗效果很大程度决定于其是否能通过机体内的种种屏障，以有效浓度到达靶点组织，所以选择一种既安全又高效的体内递送siRNA的缓释基因载体成为一种迫切的需要。基于壳聚糖(CS)阳离子多聚物的纳米粒有望成为新一代安全高效的基因载体。由于壳聚糖纳米粒不具有定向的靶向性，对其进行修饰和改造以提高其靶向性成为亟待解决的问题。研究表明，透明质酸(HA)能与细胞表面的CD44受体结合而发挥信号传递与调节细胞生理功能的作用。多种肿瘤细胞表面的CD44受体过度表达，同时相应的正常细胞中表达量并不高。所以，将HA偶联到CS纳米粒上，利用HA与细胞表面CD44具有较强亲和力的特性，可向肿瘤组织输送包裹siRNA的纳米粒，大大提高给药的靶向性。传统方法是通过正负电荷的作用将HA偶联到CS纳米粒上。然而，正负电荷的作用在体内常常由于酸碱度的改变而不稳定，导致偶联上的HA丢失。专利技术专利申请201410572404.8公开了“一种改性透明质酸及其制备方法”。该申请通过氧化透明质酸主链糖苷环中的还原性羟基，使糖苷环从相邻的羟基处断链开环，形成具有活性较高的多醛基结构，在不影响材料本身的亲水性以及生物相容性的同时，引入了高活性反应基团。然而，该申请所述的方法存在以下问题：(1)反应温度高，为40-70℃，易导致壳聚糖分子量的降低；(2)透明质酸在水溶液中的质量浓度范围小，仅为1-5％，从而限制了反应的量；(3)反应完毕后需要反复透析洗涤处理才可以得到改性透明质酸，操作复杂；(4)搅拌反应时间长达3-24h，从而导致整个操作过程的时间较长，易导致反应后的醛基活性降低。此外，还没有氧化透明质酸与壳聚糖纳米粒结合作为CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系的相关报道。
技术实现思路
基于目前采用壳聚糖(CS)纳米粒的基因靶向输送技术的现状，本专利技术将siRNA包载于CS纳米粒中，并通过氧化改性后的透明质酸(HA)对CS纳米粒进行修饰，从而得到肿瘤靶向纳米粒。本专利技术还选取CD44高表达膀胱癌及肾癌细胞系，评价该纳米缓释基因载体在肿瘤靶向治疗中的作用，探讨其作为基因靶向输送载体的可行性，为临床开发应用和探索CD44高表达型肿瘤基因治疗的新途径提供依据。本专利技术的技术方案：针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸HAD共价交联到壳聚糖纳米粒CSNPs上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒。其中，所述壳聚糖纳米粒CSNPs为包裹siRNA的壳聚糖纳米粒，即CSNps-siRNA。所述HAD的结构式如下所示：其中，所述氧化透明质酸HAD中醛基的数目为2个。所述氧化透明质酸HAD采用醇相反应制备得到。所述醇相反应制备HAD具体包括以下步骤：(a)将适量透明质酸溶解在乙醇中得到透明质酸的乙醇溶液；(b)将适量氧化剂溶解在水中得到氧化剂溶液，并在20-25℃的温度条件下将其加入到步骤(a)制备的透明质酸的乙醇溶液中，搅拌至氧化反应完毕；(c)采用浓度不小于95％的乙醇沉淀并洗涤后得到改性透明质酸。所述透明质酸的糖苷环单元与氧化剂的摩尔比为2:1-10:1。所述溶解透明质酸采用的乙醇为体积分数为60-95％的乙醇，所述透明质酸在乙醇溶液中的质量体积比为5-10％，所述氧化剂溶液的浓度为0.1-1M。本申请采用的醇相反应在室温下室温即可进行，不需要加热；而且透明质酸HA在乙醇溶液中处于溶胀状态，而非溶解态，所以浓度可以在5-10％(w/v)，一次性反应量大大增加。基因靶向输送体系的应用，将其应用于CD44高表达型肿瘤中siRNA的转运体系。所述CD44高表达型肿瘤为膀胱肿瘤、肺癌肾癌。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术利用壳聚糖纳米粒作为缓释载体的优势，联合siRNA技术，以及透明质酸(HA)能与膀胱癌组织中高表达的CD44受体特异性结合而介导的靶向性，将siRNA包载于CS纳米粒中，并通过氧化改性后的HA对其进行修饰，制备肿瘤靶向纳米粒，解决了现有技术中HA丢失导致的问题。(2)本专利技术提供的CSNps-siRNA-HAD靶向纳米粒作为CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，为临床上CD44高表达型肿瘤基因治疗的新途径提供了依据。(3)采用本专利技术所述的基因靶向输送体系，可以在不伤害正常细胞的前提下取得良好的治疗效果，具备积极的社会效应和丰厚的经济效益，市场应用前景巨大。说明书附图附图1是CSNPs、CSNps-HAD与CSNPs-HA纳米粒粒度分布图(微米)；附图2是扫描电镜下CSNPs、CSNps-HAD与CSNPs-HA纳米粒的形态；附图3是琼脂糖凝胶电泳检测壳聚糖纳米粒对siRNA的包载量的测定；附图4是CD44在膀胱癌、肾癌及正常膀胱和肾细胞中的表达；附图5是采用荧光显微镜观察CSNPs纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒对O786细胞的转染效果(100×)；附图6是采用Westernblot检测CSNPs纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒携带Bcl2-siRNA对O786细胞靶蛋白的的干扰效果(100×)；附图7是采用荧光显微镜观察CSNPs纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒对T24细胞的转染效果(100×)；附图8是采用Westernblot检测CSNPs纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒携带Bcl2-siRNA对T24细胞靶蛋白的的干扰效果(100×)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1：针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸HAD共价交联到壳聚糖纳米粒CSNPs上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒。其中，所述壳聚糖纳米粒CSNPs为包裹siRNA的壳聚糖纳米粒，即CSNps-siRNA。所述HAD的结构式如下所示：针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，采用以下方法制备得到：(1)将氧化透明质酸HA通过醇相反应得到带两个醛基的透明质酸HAD：(a)称取2g透明质酸(HA)，搅拌下加入95％(v/v)的乙醇中，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，其特征在于：所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸HAD共价交联到壳聚糖纳米粒CSNPs上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒，所述HAD的结构式为：

【技术特征摘要】
1.针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，其特征在于：所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸HAD共价交联到壳聚糖纳米粒CSNPs上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒，所述HAD的结构式为：2.根据权利要求1所述的基因靶向输送体系，其特征在于：所述壳聚糖纳米粒CSNPs为包裹siRNA的壳聚糖纳米粒，即CSNps-siRNA。3.根据权利要求1或2所述的基因靶向输送体系，其特征在于：所述氧化透明质酸HAD中醛基的数目为2个。4.根据权利要求3所述的基因靶向输送体系，其特征在于：所述氧化透明质酸HAD采用醇相反应制备得到。5.根据权利要求4所述的基因靶向输送体系，其特征在于：所述醇相反应具体包括以下步骤：(a)将适量透明质酸溶解在乙醇中得到透明质酸的乙醇溶液；(b)将适量氧化剂溶解在水中得到氧化剂溶液，并将其...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛海涛，梁晔，王丽萍，李丹，梁志娟，陈元斌，张文华，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东,37