一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术以含有野生型肌醇氧化酶编码基因的质粒pACYCDuet‑MIOX‑Udh为模板，使用易错PCR技术，获得肌醇氧化酶MIOX随机突变文库；利用生物传感器高通量筛选获得高GA产量肌醇氧化酶突变体，该肌醇氧化酶突变体具有较高的催化活性，可应用于酶工程、基因工程以及代谢工程等领域。

A mutant of inositol oxidase and its coding gene and Application

The invention relates to a mutant of inositol oxidase and a coding gene and application thereof, belonging to the field of gene engineering technology. In this invention, a random mutation library of inositol oxidase MIOX was obtained using the plasmid pACYCDuet MIOX Udh containing wild type inositol oxidase encoding gene, and a random mutation library of inositol oxidase MIOX was obtained by error prone PCR technology. The mutants of high GA production inositol oxidase were obtained by high throughput screening of biosensors. The mutants of this myosol oxidase mutant had high catalytic activity. It can be applied to enzyme engineering, genetic engineering and metabolic engineering.

【技术实现步骤摘要】
一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用
本专利技术涉及一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用，属于基因工程

技术介绍
葡萄糖二酸(Glucaricacid,GA)是一种六碳单糖衍生物，广泛存在于蔬菜、水果等植物中以及少数哺乳动物体内。葡萄糖二酸的应用同样广泛，从膳食补充剂比如D-葡糖酸钙，到降低胆固醇和抗癌药物的研究。GA被美国能源部归类为最具高价值回报的30种化合物之一，其重要性不仅在于其自身的用途，更因为它的多种具有更高价值的衍生物，比如尼龙、塑料和食品添加剂(Werpy,T.,andG.Petersen.2004.Top.valueaddedchemicalsfrombiomass,volume1—resultsofscreeningforpotentialcandidatesfromsugarsandsynthesisgas.U.S.De-partmentofEnergy,Washington,DC.http://www.pnl.gov/main/publications/external/technical_reports/PNNL-14808.pdf.)。目前，GA工业生产仍几乎全部为化学方法，以葡萄糖为原料氧化合成。其中应用最多的方法为硝酸氧化法，以硝酸为氧化剂，氧化时无选择性，温度高且耗能高，但产量低，同时伴随有毒性副产物的生成，此外不可避免的成本也较高(Zhang,Z.A.-O.h.o.o.andG.W.A.-O.h.o.o.Huber,Catalyticoxidationofcarbohydratesintoorganicacidsandfuranchemi-cals.LID-10.1039/c7cs00213k[doi].(1460-4744(Electronic)))。鉴于此，目前的方法越来越满足不了对GA不断增加的需求，所以有必要寻找成本更低且环境更友好的替代方法。随着近年来合成生物学以及代谢工程的发展越来越成熟，使利用基因重组技术调节细胞功能成为可能。因此，使用生物生产系统作为活体催化剂催化合成目的产物的方法可能会得到更高的催化选择性和更高的产量，也吸引了越来越多的生物化学科学家们的研究兴趣。GA的生物合成途径已经建成，该途径以大肠杆菌为宿主，由1-磷酸肌醇合成酶(myo-inositol-1-phosphatesynthasefromSaccharomycescerevisiae,Ino1)、肌醇氧化酶(myo-inositoloxygenasefromMusmusculus,MIOX)和葡萄糖醛酸脱氢酶(uronatedehy-drogenasefromPseudomonassyringae,Udh)三种外源重组蛋白组成，将底物葡萄糖最终转化为GA(Moon,T.S.,etal.,ProductionofGlucaricAcidfromaSyntheticPathwayinRecombinantEscherichiacoli.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2009.75(3):p.589-595.)。据研究表明，该路径的限速酶为肌醇氧化酶MIOX，肌醇氧化酶MIOX的活性越高则GA的产量越高(Moon,T.S.,etal.,Useofmodular,syntheticscaffoldsforimprovedproductionofglucaricacidinengineeredE.coli.MetabolicEngineering,2010.12(3):p.298-305.)。如何提高MIOX的活性(比如稳定性、溶解性和比活性)便成为了提高GA产量亟待解决的问题之一。SUMO标签具有可以提高蛋白的可溶性表达，将其重组在肌醇氧化酶上游，明显提高了肌醇氧化酶的溶解性(Shiue,E.andK.L.J.Prather(2014)."ImprovingD-glucaricacidproductionfrommyo-inositolinE.colibyincreasingMIOXstabilityandmyo-inositoltransport."MetabolicEngi-neering22(SupplementC):22-31)。此外，研究发现，该GA合成途径以大肠杆菌为宿主时，当GA产量高于5g/L时，由于伴随生产过程而产生的pH介导的酸毒性的存在(Moon,T.S.,etal.,Useofmodular,syntheticscaffoldsforimprovedproductionofglucaricacidinengineeredE.coli.MetabolicEngineering,2010.12(3):p.298-305.)，GA产量无法进一步提高，这使得更换宿主成为必要。作为在生物技术中应用得广泛而成熟仅次于大肠杆菌的工程菌株，酿酒酵母因其天然的耐酸性，成为GA合成途径更换宿主时的首选(Gupta,A.,etal.,Portingthesyn-theticD-glucaricacidpathwayfromEscherichiacolitoSaccharomycescerevisiae.(1860-7314(Electronic)).)。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用。本专利技术以含有野生型肌醇氧化酶(Genebank：NP_064361.2)编码基因的质粒pACYCDuet-MIOX-Udh为模板，使用易错PCR技术，获得肌醇氧化酶MIOX随机突变文库；利用生物传感器高通量筛选获得高GA产量肌醇氧化酶突变体，该肌醇氧化酶突变体具有较高的催化活性，可应用于酶工程、基因工程以及代谢工程等领域。本专利技术的技术方案如下：一种肌醇氧化酶突变体MIOX(D82Y/S173N)，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶相比，第82位的氨基酸残基由天门冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y)，第173位的氨基酸残基由丝氨酸(S)突变为天门冬酰胺(N)，所述肌醇氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种肌醇氧化酶突变体编码基因，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶编码基因相比，第244位核苷酸由G突变为T，518位核苷酸由G突变为A，所述突变体编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一种重组质粒载体，其特征在于，含有上述肌醇氧化酶突变体编码基因。根据本专利技术优选的，上述重组质粒载体为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)。一种重组质粒载体，其特征在于，含有上述肌醇氧化酶突变体编码基因以及葡萄糖醛酸脱氢酶(Udh)编码基因。根据本专利技术优选的，上述重组质粒载体为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)-Udh。一种表达肌醇氧化酶突变体的宿主细胞，其特征在于，含有上述肌醇氧化酶突变体编码基因或重组质粒载体。根据本专利技术优选的，上述宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌。根据本专利技术优选的，上述重组质粒载体pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和pACYCDuet本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌醇氧化酶突变体MIOX(D82Y/S173N)，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶相比，第82位的氨基酸残基由天门冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y)，第173位的氨基酸残基由丝氨酸(S)突变为天门冬酰胺(N)，所述肌醇氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种肌醇氧化酶突变体MIOX(D82Y/S173N)，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶相比，第82位的氨基酸残基由天门冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y)，第173位的氨基酸残基由丝氨酸(S)突变为天门冬酰胺(N)，所述肌醇氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种肌醇氧化酶突变体编码基因，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶编码基因相比，第244位核苷酸由G突变为T，518位核苷酸由G突变为A，所述突变体编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组质粒载体，其特征在于，含有权利要求2所述的肌醇氧化酶突变体编码基因。4.如权利要求3所示的重组质粒载体，其特征在于，重组质粒载体为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)。5.一种重组质粒载体，其特征在于，含有权利要求2所述的肌醇氧化酶突变体编码基因以及葡萄糖醛酸脱氢酶(Udh)编码基因。6.如权利要求5所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：生举正，王凤山，郑爽，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37