预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体。预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，包括步骤：1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的预苯酸脱氢酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；2)纯化抗血清得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。本发明专利技术利用PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到预苯酸脱氢酶基因，并通过基因工程技术得到Ecoli BL21‑pET21a‑PDG重组菌株，诱导表达重组菌株得到预苯酸脱氢酶蛋白，该蛋白具有较好的低温耐受，而且以预苯酸脱氢酶为抗原成功得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，该多克隆抗体能够准确检测预苯酸脱氢酶。

Prebenzoic acid dehydrogenase and its polyclonal antibody

The invention relates to the field of molecular biology, in particular to a pre benzoic acid dehydrogenase and its polyclonal antibody. The preparation method of polyclonal antibody of prebenzoic acid dehydrogenase consists of steps: 1) the prebenzoic acid dehydrogenase as an antigen as shown in the amino acid sequence such as SEQ ID No.1, immunized mice to prepare antiserum; 2) the polyclonal antibody of prebenzoic acid dehydrogenase was purified by the purified antiserum. The prebenzene dehydrogenase gene was amplified by PCR technology in the Cryobacterium of the genus coriobacterium, and the recombinant strain of Ecoli BL21 pET21a PDG was obtained by genetic engineering technology to induce the recombinant strain to obtain prebenzene dehydrogenase protein. The protein had good low temperature tolerance, and the prephenyl dehydrogenase was used as a prebenzene dehydrogenase. The polyclonal antibody of pre benzoic acid dehydrogenase was successfully obtained from the antigen. The polyclonal antibody can accurately detect the prebenzoic acid dehydrogenase.

【技术实现步骤摘要】
预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体。
技术介绍
预苯酸脱氢酶，别名：预沉淀脱氢酶，英文名：prephenatedehydrogenase。预苯酸脱氢酶存在于莽草酸途径中，对合成酪氨酸有重大作用。预苯酸脱氢酶催化预苯酸生成4-羟基苯基丙酮酸，4-羟基苯基丙酮酸通过转氨作用生成L-酪氨酸。L-酪氨酸能够改善记忆和精神警觉性，控制抑郁和焦虑，L-酪氨酸也是黑色素、左旋多巴等多种高价值化合物的原料，被应用于工业生产(参考文献BonuccelliU，DelDottoP.NewpharmacologichorizonsinthetreatmentofParkinsondisease[J].Neurology,2006.67(7Suppl2):30-38)。目前国内外对预苯酸脱氢酶的研究主要集中在Aquifexaeolicus、Streptococcusmutant、Haemophilusinfluenza以及环境未培养微生物，鲜见对于一些极端微生物比如耐冷，耐热，耐酸，耐碱等微生物中预苯酸脱氢酶的研究。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术提供一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体，得到了来源于耐冷微生物中的预苯酸脱氢酶，该预苯酸脱氢酶具有低温酶的特性，而且制备得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，能够准确检测预苯酸脱氢酶。本专利技术的目的之一是提供一种预苯酸脱氢酶的氨基酸序列；所述预苯酸脱氢酶序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的目的之二是提供一种编码预苯酸脱氢酶的氨基酸基因的碱基序列；所述预苯酸脱氢酶的氨基酸基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的目的之三是提供一种预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法。预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：1)以氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的预苯酸脱氢酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；2)纯化抗血清得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。进一步地，所述预苯酸脱氢酶的制备方法为：1.1)利用PCR技术扩增SEQIDNO.2所示的碱基序列；1.2)将SEQIDNO.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建预苯酸脱氢酶的表达载体；1.3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到预苯酸脱氢酶蛋白。进一步地，所述纯化抗血清的方法为：将预苯酸脱氢酶蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，再将待纯化的抗血清与PBS按照1:1比例混合后经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与预苯酸脱氢酶蛋白结合完全后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。更进一步地，所述步骤1.1)中，PCR技术扩增所用的引物为：正向引物如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4所示。更进一步地，所述步骤1.2)中载体质粒为pET21a(+)。更进一步地，所述步骤1.3)中，大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。更进一步地，所述步骤1.3)中，所述纯化蛋白过程中利用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行蛋白纯化。本专利技术的优点在于：1，本专利技术通过PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到预苯酸脱氢酶基因，并且通过NCBIBlast碱基序列比对证明该预苯酸脱氢酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的预苯酸脱氢酶基因序列。通过基因工程技术得到表达预苯酸脱氢酶蛋白的EcoliBL21-pET21a-PDG重组菌株，诱导表达重组菌株得到预苯酸脱氢酶蛋白，预苯酸脱氢酶为低温酶，即在低温条件下发挥活性，具有较好低温的耐受力。2，本专利技术以预苯酸脱氢酶为抗原得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，该多克隆抗体可以准确地检测预苯酸脱氢酶蛋白。附图说明图1为PCR扩增预苯酸脱氢酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为DNAmarker，1号泳道为PCR扩增预苯酸脱氢酶基因的产物；图2为表达载体pET21a-PDG的构建示意图；图3为重组菌株EcoliBL21-pET21a-PDG表达预苯酸脱氢酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中Marker泳道为proteinmarker；PDG泳道为预苯酸脱氢酶蛋白；图4为预苯酸脱氢酶多克隆抗体的WesternBlotting分析图，其中Magic泳道为蛋白质分子量标准，C.b02泳道为细菌Cryobacteriumbaishanse02超声破碎离心后的上清液样品。具体实施方式为更好地理解本专利技术，以下将结合附图和具体实例对专利技术进行详细的说明。实施例1预苯酸脱氢酶基因的获取1)获取含有目的基因的菌株本专利技术利用喜冷杆菌属菌株，喜冷杆菌属菌株筛选自长白山土壤，具体的筛选过程如申请号为201710034491.5的中国专利技术专利，该菌株的命名为：Cryobacteriumbaishanse02，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2016604。保藏日期为2016年10月31日，保藏地址为，中国武汉，武汉大学。喜冷杆菌属菌株Cryobacteriumbaishanse02为耐冷菌株，在4℃的环境中仍保持较高的代谢活性。2)基因组的提取利用DNA提取试剂盒(TAKARADalian)提取Cryobacteriumbaishanse02菌株的基因组作为模板，提取的基因组样品于-20℃保存待用。3)PCR扩增目的基因设计引物：正向引物如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4所示；PCR反应体系如下表1所示：表1成分体积10×PCR缓冲液5μl引物F1μl引物R1μl模板80ngMgSO42μldNTP5μl去离子水35μl总计50μlPCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，PCR扩增产物的大小与预计的885bp接近，将PCR扩增产物切胶回收，送生物公司测序以准确判断PCR扩增产物的碱基序列，测序委托铂尚生物技术有限公司完成。测序结果如SEQIDNO.2所示，将SEQIDNO.2所示的碱基序列在NCBIBlast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行碱基序列比对，比对结果与CryobacteriumarcticumstrainPAMC27867的预苯酸脱氢酶相似性97％，即可判断SEQIDNO.2所示的碱基序列属于Cryobacterium属的新的预苯酸脱氢酶序列。实施例2构建预苯酸脱氢酶的表达载体将实施例1中得到的PCR扩增产物进行胶回收，用限制性内切酶EcoRI和NdeI对PCR扩增产物进行双酶切反应；同时用限制性内切酶EcoRI和NdeI对载体pET21a(+)进行双酶切反应，然后经高效DNA连接酶HighLigation(TOYOBO)催化连接经双酶切反应后的pET21a(+)和PCR扩增产物；构建得到预苯酸脱氢酶的表达载体pET21a-PDG，表达载体pET21a-PDG的构建如图2所示。实施例3表达和纯化预苯酸脱氢酶蛋白将实施例2得到的表达载体pET21a-PDG转化入大肠杆菌BL21的感受态菌体中，大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预苯酸脱氢酶，其特征在于：所述预苯酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种预苯酸脱氢酶，其特征在于：所述预苯酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的预苯酸脱氢酶的基因，其特征在于：所述预苯酸脱氢酶基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。3.一种预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体的抗原为SEQIDNO.1所示氨基酸序列组成的多肽。4.一种制备权利要求3所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的预苯酸脱氢酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；2)纯化抗血清得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。5.根据权利要求4所述的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述预苯酸脱氢酶的制备方法为：1.1)利用PCR技术扩增SEQIDNO.2所示的碱基序列；1.2)将SEQIDNO.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建预苯酸脱氢酶的表达载体；1.3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到预苯酸脱氢酶蛋白。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫春杰，顾昌祺，陶冶，胡征，杨波，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42