热稳定性肌醇六磷酸酶变体制造技术

本发明专利技术涉及产生肌醇六磷酸酶变体的方法，所述肌醇六磷酸酶变体与来源于布丘氏菌属的肌醇六磷酸酶具有至少70%同一性并与该肌醇六磷酸酶相比包含至少一个其它的二硫键。这些肌醇六磷酸酶变体具有修饰的，优选改善的性质，如热稳定性、温度概貌、pH概貌、比活性、在动物饲料中的性能、减少的蛋白酶敏感性和/或修饰的糖基化样式。本发明专利技术亦涉及产生的变体，编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，其产生方法，及其例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从亲本肌醇六磷酸酶产生变体肌醇六磷酸酶的方法，所述变体肌醇六磷酸酶当使用Needle程序用BL0SUM62取代矩阵，10. O的缺口开放罚分和O. 5的缺口延伸罚分与相应的氨基酸序列进行比对时，与SEQ ID NO:2的氨基酸1-413，SEQ ID NO:4的氨基酸1-413，和/或SEQ ID NO:6的氨基酸1-413具有至少70%同一性，并与这些及紧密相关的肌醇六磷酸酶相比包含至少一个二硫桥联的建立(即，为其变体)，所述桥联不属于四个天然存在的二硫桥联。本专利技术还涉及产生的变体和编码这些变体的DNA，以及它们的用途,例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。·
技术介绍

技术介绍
肌醇六磷酸酶是公知的酶，将其添加至动物包括人类的食料中的优点也是公知的。已从多种来源，包括多种真菌和细菌菌株分离出肌醇六磷酸酶。本专利技术的一个目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的替代性多肽(肌醇六磷酸酶)和编码所述多肽的多核苷酸。本专利技术的肌醇六磷酸酶变体与亲本肌醇六磷酸酶相比呈现修饰的或改变的，优选改善的性质。此类性质的非限定性实例为稳定性(如酸稳定性，热稳定性，蒸汽稳定性，造粒稳定性和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性)，温度概貌(profile)，pH概貌，比活性，底物特异性，在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)，对糖化作用(glycation)的易感性,和/或糖基化样式。如本文中所述，采用编码肌醇六磷酸酶的亲本多核苷酸的诱变以制备编码相对于由亲本多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶具有改善的性质的肌醇六磷酸酶的变体(合成)DNA。已知多种组氨酸磷酸(HAP)类型的肌醇六磷酸酶的三维结构(例如Lim等Nature struct, biol. 7，108-113 (2000))。由此发现，其均具有位于位置对77/108133/407178/187381/390(根据本文中使用的编号)的四个二硫桥联。通常这些桥联占用了分子中存在的所有半胱氨酸。布丘氏菌属(Buttiauxiella)WO 2006/043178 公开了一种来自布丘氏菌属 Pl_29 (Buttiauxella P1-29)(作为NCIMB 41248保藏)的具有WO 2006/043178中SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，及其某些变体。布丘氏菌属野生型肌醇六磷酸酶的序列及其多种变体已经提交至GENESEQP数据库，具有以下登录号AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075 和 AEH25076。这些肌醇六磷酸酶均与SEQ ID N0:2、4和6中的任何一个具有70%以上的同一性百分比。来自变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus)的肌醇六磷酸酶的序列已经提交至UNIPR0T 数据库，登录号为 Q6U677。这种也由 Zinin 等在 FEMS Microbiology Letters, 236卷，283-290页，2004中进行了描述的肌醇六磷酸酶，与SEQ ID N0:2、4和6具有超过70%的同一性百分比。WO 2008/192901 公开了来自 Buttiauxella gaviniae DSM18930，乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)DSM18931,和乡间布丘氏菌DSM18932的肌醇六磷酸酶，及其多种变体。这些肌醇六磷酸酶提供于本文中的SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6。W02008097619亦公开了来源于布丘氏菌属菌种菌株P 1_29的肌醇六磷酸酶变体，特别是命名为BP-Il的变体，及其一些变体。WO 20091100183进一步公开了来源于布丘氏菌属菌种P1-29肌醇六磷酸酶或BP-Il变体的变体。附图和序列表简述图I显示SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6的预期的成熟部分连同具有以下 GENESEQP 登录号的序列的多重比对AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075 和 AEH25076。比对是使用 Clustal 方法(Higgins, 1989，CABIOS 5:151-153)，使用 LASERGENE MEGALIGN 软件(DNASTAR, Inc.，Madison, WI)，用同一性表和以下多重比对参数进行的缺口罚分为10,并且缺口长度罚分(gap length penalty)为10。配对比对参数是 K 元组(Ktuple)=I,缺口罚分=3,窗口(windows) =5,和对角线(diagonals) =5。图2显示UNIPR0T登录号Q6U677与SEQ ID NO: 2的氨基酸1-413的比对。比对是使用Needle程序，使用矩阵BL0SUM62、10. O的缺口产生罚分和0. 5的缺口延伸罚分进行的。序列表中序列如下所示 SEQ ID NO: I Buttiauxella gaviniae DSM18930 SEQ ID NO:2 Buttiauxella gaviniae DSM18930 SEQ ID NO:3 乡间布丘氏菌DSM18931 SEQ ID NO:4 乡间布丘氏菌DSM18931 SEQ ID NO :5 乡间布丘氏菌DSM18932 SEQ ID NO :6 乡间布丘氏菌DSM18932实施例概述在本说明书中提供了下述实施例实施例I :变体的制备和活性的确定实施例2 比活性实施例3 :通过DSC测量热稳定性实施例4 :温度概貌实施例5 :在体外模型中在动物饲料中的性能实施例6 :在猪体内试验中的性能
技术实现思路
本专利技术涉及从亲本肌醇六磷酸酶产生变体肌醇六磷酸酶的方法，所述变体肌醇六磷酸酶a)当使用Needle程序用BL0SUM62取代矩阵，10. O的缺口开放罚分和O. 5的缺口·延伸罚分与相应的氨基酸序列进行比对时，与SEQ ID NO:2的氨基酸1-413，SEQ ID NO:4的氨基酸1-413，和/或SEQ ID NO:6的氨基酸1-413具有至少70%同一性；和b)与SEQ ID N0:2相比，包含至少一个二硫桥联的建立，其中所述二硫桥联不属于在位置79/110，135/410，180/189和384/393的四个天然存在的二硫桥联。同一性百分比如段落“肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比”中所述确定。位置编号指SEQ ID NO:2中的位置编号，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L德玛利亚，LK斯科夫，M斯科乔伊特，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：
国别省市：