葡萄糖二酸的制造方法技术

本发明专利技术的课题在于提供具有显著改善的葡萄糖二酸生产能力的转化体的制作方法和利用该转化体有效生产葡萄糖二酸的方法。在本发明专利技术的葡萄糖二酸的制造方法中，向保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因的转化体中导入对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】葡萄糖二酸的制造方法
本专利技术涉及基因重组技术在葡萄糖二酸的制造中的应用。
技术介绍
葡萄糖二酸(四羟基己二酸)是在植物和哺乳动物中早已发现的化合物。近年来，在美国国家再生能源研究所关于需要由生物物质制作的高附加值化学品的报告(非专利文献1)中举出了葡萄糖二酸作为前12名以内的化合物。在该报告中作为可以以葡萄糖二酸为原料制备出的葡萄糖二酸衍生物还示例出了葡糖二酸-γ-内酯、葡糖二酸-δ-内酯或葡糖二酸二内酯等内酯类(可期待其作为溶剂的用途)；多羟基聚酰胺类(可期待其作为新型尼龙的用途)等。此外，该报告中还推测可利用淀粉的硝酸氧化反应或碱性漂白剂存在下的催化氧化反应作为已知的葡萄糖二酸制造方法。进一步地，最近在专利文献1中公开了可进行葡萄糖二酸的生物合成的转化体。即，在该专利文献中，分别编码肌肉肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)、肌肉肌醇加氧酶(MIOX)和糖醛酸脱氢酶(udh)的3个基因被转染至大肠杆菌宿主中。这样得到的转化体在培养基内以0.72g/L～1.13g/L的浓度生产出了葡萄糖二酸。但是，据专利文献1的专利技术人推测，在该专利文献的转化体中无需导入肌醇单磷酸酶(suhB)基因。即，在以葡萄糖为底物进行葡萄糖二酸的生物合成的通路中，理论上需要下述5种活性：活性1：由适当的碳源生成葡萄糖-6-磷酸的活性；活性2：将葡萄糖-6-磷酸转换为肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成酶活性；活性3：将肌肉肌醇-1-磷酸转换为肌肉肌醇的活性、即以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的磷酸酶活性；活性4：将肌肉肌醇转换为葡萄糖醛酸的活性、即肌肉肌醇加氧酶活性；和活性5：将葡萄糖醛酸转换为葡萄糖二酸的活性、即糖醛酸脱氢酶活性。但是，实际上，由于活性1的产物葡萄糖-6-磷酸为原核微生物普遍生成的代谢中间体，因而无需对原核微生物赋予该活性。此外，关于活性3，已知也有不少微生物株表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的通用单磷酸酶活性。因而，在专利文献1的转化体中没有导入肌醇单磷酸酶基因。并且，在专利文献1中，基于所制作的转化体的代谢分析，得出在用于进行葡萄糖二酸的生物合成的转化体中无需导入肌醇单磷酸酶基因的结论。即，在专利文献1中记载了下述内容：“应当注意的是，我们并没有过量表达suhB基因或同源磷酸酶。但是，培养产物中未检测到肌肉肌醇-1-磷酸，而另一方面，却有肌肉肌醇的积聚。因此，我们得出结论：磷酸酶活性并不限制通过该通路的代谢的流量(flux)。”(第33页、第2～5行)。因而并不存在将肌醇单磷酸酶基因导入到用于葡萄糖二酸的生物合成的转化体中的明确动机。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2009/145838号小册子非专利文献非专利文献1：TopValueAddedChemicalsfromBiomassVolumeI-ResultsofScreeningforPotentialCandidatesfromSugarsandSynthesisGas””、http://www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf、T.Werpy和G.Peterson编、2004年8月发行
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术所要解决的课题在于具有显著改善的葡萄糖二酸生产能力的转化体的制造及其应用。解决课题的手段如上所述，即使是在公开了能够生物合成葡萄糖二酸的转化体的专利文献1中，也并未向该转化体中导入肌醇单磷酸酶基因，并且该活性也并未引起特别的关注。但是，与专利文献1的预想相反，本专利技术人发现，肌醇单磷酸酶活性在用于葡萄糖二酸生物合成的转化体中具有重要作用。特别值得吃惊的是，通过增强肌醇单磷酸酶活性，这样的转化体的葡萄糖二酸生产能力提高了数十～百倍。因而，本专利技术的第一方面在于：(1)一种葡萄糖二酸的制造方法，其包括下述工序：1)准备转化体的工序，该转化体保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，并具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异；2)在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下，使该转化体与能够由该转化体转换为葡萄糖二酸的碳源进行接触的工序；以及3)从在上述2)中得到的培养物中分离出葡萄糖二酸或者葡萄糖二酸盐的工序。更特定地说，上述制造方法为使用转化体的葡萄糖二酸的制造方法，该转化体保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，其特征在于，上述转化体具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。本专利技术葡萄糖二酸的发酵生产中，使用下述碳源作为培养基材是适宜的，该基材含有适于生成作为肌醇-1-磷酸合成酶(上述活性2)的底物的葡萄糖-6-磷酸的化合物。因而，本专利技术的适宜方式为：(2)如上述(1)所述的制造方法，其中，上述碳源包括可在上述转化体内转换为葡萄糖-6-磷酸的化合物；和(3)如上述(2)所述的制造方法，其中，上述碳源为选自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜以及含有D-葡萄糖的生物物质组成的组中的1种以上。对于以大肠杆菌为代表的原核微生物来说，由于其迅速的生长能力以及发酵管理的容易性，因而从工业发酵生产的方面考虑是极富魅力的，同时从应用基因重组技术时的实际成绩、可靠的安全性的方面考虑也具有优点。此外，对于不具有从葡萄糖经肌肉肌醇来生物合成葡萄糖二酸的通路的多数原核微生物来说，通过使用与基因重组技术联合的合成生物学方法，具有容易调节葡萄糖二酸生产率的优点。特别是大肠杆菌等原核微生物宿主不具有对作为葡萄糖二酸生物合成通路中间体的肌肉肌醇的同化能力(分解能力)，因而更容易应用合成生物学的方法。因而，本专利技术的适宜方式包括：(4)如上述(1)至(3)的任一项所述的制造方法，其特征在于，上述转化体来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；和(5)如上述(1)至(4)的任一项所述的制造方法，其中，上述转化体来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性，均可通过肌醇单磷酸酶在该细胞内的过剩生产来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。可应用各种公知的技术使肌醇单磷酸酶在细胞中过剩生产。因而，本专利技术包括下述方式：(6)如上述(1)至(5)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化体进行以下操作而被诱导的：a)导入外来肌醇单磷酸酶基因、b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数、c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异、d)利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域、或者e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失；和(7)如上述(6)所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化体导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。此外，在宿主细胞具有内源性肌醇单磷酸酶基因的情况下，也可利用下述方式来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。(8)如上述(1)至(5)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述转化体进行以下操作而被诱导的：f)在内源性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖二酸的制造方法，其包括下述工序：1)准备转化体的工序，该转化体保有肌醇‑1‑磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，并具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异；2)在适于所述转化体的生长和/或维持的条件下，使该转化体与能够由该转化体转换为葡萄糖二酸的碳源进行接触的工序；以及3)从在所述2)中得到的培养物中分离出葡萄糖二酸或者葡萄糖二酸盐的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.24 JP 2012-0391291.一种葡萄糖二酸的制造方法，其包括下述工序：1)准备转化体的工序，该转化体保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脱氢酶基因，来源于大肠杆菌，并具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产进行诱导的基因重组，所述转化体的特征在于保有包含编码肌醇-1-磷酸合成酶的核酸的表达盒、包含编码肌醇单磷酸酶基因的核酸的表达盒、包含编码肌肉肌醇加氧酶的核酸的表达盒和包含编码糖醛酸脱氢酶的核酸的表达盒的4种表达盒；2)在适于所述转化体的生长和/或维持的条件下，使该转化体与能够由该转化体转换为葡萄糖二酸的碳源进行接触的工序；以及3)从在所述2)中得到的培养物中...

【专利技术属性】
技术研发人员：小西一诚，今津晋一，
申请(专利权)人：旭化成化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP