本发明专利技术涉及增强蛋白质的领域，特别涉及通过分子改变增强的蛋白质领域。本发明专利技术涉及所谓的增强的肌醇六磷酸酶变体，其特征在于所述肌醇六磷酸酶变体具有比原肌醇六磷酸酶好的热稳定性和/或活性。本发明专利技术还涉及编码所述变体的核酸、含有所述变体的表达盒或表达载体、表达所述变体的宿主细胞、包含所述变体的组合物以及其主要在制备食品添加剂和动物饲料中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强的肌醇六磷酸酶变体本专利技术涉及增强蛋白质领域，特别是通过分子改变而增强的蛋白质领域。它涉及称作增强的肌醇六磷酸酶的变体，因为与原肌醇六磷酸酶相比它具有较好的热稳定性和/ 或活性。本专利技术还涉及编码所述变体的核酸，含有所述变体的表达盒或表达载体，表达所述变体的宿主细胞，包括所述变体的组合物，以及还涉及其主要在食品添加剂和动物饲料制备中的用途。肌醇六磷酸酯(phytate)是植物中主要的磷储存化合物。该分子，也被称作肌醇六磷酸(phytic acid)或六磷酸肌醇酯(inositol-hexa-phosphate) (InsP6或肌醇六磷酸酯(myo-inositol hexakisphosphate))，由环己烷组成，六个磷酸酯基团结合到该环己烷。 肌醇六磷酸酯代表大约70%的植物磷酸酯，剩下30%以游离形式存在。另外，肌醇六磷酸酯的磷酸酯残基螯合二价和三价阳离子，如钙、铁、锌、镁、铜、锰和钼，这些阳离子是营养所必需的。肌醇六磷酸酶是水解肌醇六磷酸酯的酶这种酶自然地释放一种或两种磷酸酯， 很少是三种，该磷酸酯然后被吸收进入消化系统；其它的反应产物很少是肌醇三磷酸酯，主要是肌醇四磷酸酯和肌醇五磷酸酯(附图说明图1)。肌醇六磷酸酶构成酶家族，其在自然界中被广泛代表许多生物体一从细菌到借助真菌的植物和某些动物一表达它们中的一种或多种。然而，哺乳动物不表达任意一种，反刍动物或多胃动物如牛和马在它们的胃肠道中具有降解肌醇六磷酸酯的内源微生物，但是这并不适用于单胃动物，例如，主要是猪和家禽，所以源自摄食的植物的肌醇六磷酸酯不代表有用的磷来源。因此，必需向它们的饲料中加入游离的磷酸酯。然而，那些加入的游离磷酸酯的部分和动物摄食的几乎所有肌醇六磷酸酯被排入到环境中。肌醇六磷酸酯然后在土壤中被细菌降解并且以游离磷酸酯的形式最后处于地下水和河流中。在畜牧业高度集中的地区，这种农业-工业磷酸酯废物一呈游离形式或呈肌醇六磷酸酯形式一代表主要的污染来源，这特别地导致河流和河道中的绿藻类增殖。除了美观方面外，这种藻类具有重要的生态影响，因为它们与当地的植物种类竞争， 特别是在溶解氧的消耗方面。哺乳动物能利用以肌醇六磷酸酯形式储存的磷酸酯作为磷酸酯来源的一个方法是将外源肌醇六磷酸酶引入到食物中。因此加入所述酶代表利用无机磷酸酯作为食品补充剂的替代方案。另外，通过使肌醇六磷酸酯的磷酸酯可及，它们还能对螯合到肌醇六磷酸酯的磷酸酯上的金属离子以及对结合到肌醇六磷酸酯的蛋白质提供较好的可及性，使它们在营养上可用。肌醇六磷酸酶目前在动物饲料中被相对系统地使用。它们被用作磷酸酯的部分替代品，它们还使蛋白质、氨基酸和钙更加可及。然而，在动物饲料中使用肌醇六磷酸酶存在几个限制-肌醇六磷酸酶释放磷酸酯不够有效构成第一个限制。即使在外源肌醇六磷酸酶存在的情况下，仍然将磷酸酯添加到动物饲料中。然而，如果所有肌醇六磷酸酯被转化成游离的磷酸酯，那么将不再需要补充物。因此，对提出更有活性的肌醇六磷酸酶存在真正的需求。-目前使用的大多数酶不能被直接加入到饲料中，因为它们不能经受住制粒工艺，该工艺包括将饲料加热到95°C持续90秒。因此在制粒阶段之后将酶喷雾到饲料上，这代表额外的成本并构成第二个限制；因此，对于获得更加热稳定的肌醇六磷酸酶存在极大需求。本专利技术的目的是通过产生这样的肌醇六磷酸酶而克服目前的限制，所述肌醇六磷酸酶有足够的活性以对补充磷酸酯的需要具有实质影响，并且是足够热稳定的以便能够被直接加入到动物的饲料中，而不必使用喷雾技术。许多肌醇六磷酸酶已在出版物和专利申请中被表征，或甚至已在农业-工业应用中使用。然而，它们都没有能够免除用磷酸酯补充畜牧场动物饲料的需要，并且它们都不是足够热稳定的以便直接加入到动物饲料中而不必使用喷雾技术。大多数出版物涉及来自黑曲霉(Aspergillus niger)和大肠杆菌(Escherichia coli)的肌醇六磷酸酶。微生物来源或源自植物的其它肌醇六磷酸酶也已被研究，问题是获得具有大于黑曲霉比活性(250U/mg)的热稳定肌醇六磷酸酶。文献和专利申请中描述的肌醇六磷酸酶涉及真菌(担子菌和子囊菌)、酵母和细菌。许多肌醇六磷酸酶已被从真菌中分离并且主要源自曲霉属(Aspergillus)家族，但也源自犁头霉属(Absidia)、端梗霉属(Acrophialophora)、田头菇属(Agrocybe)、 Calcarisporiella、毛壳菌属(Cheatomium)、棒囊壳属(Corynascus)、毛霉菌(Mucor)、 菌丝体(Mycelia)、Myriococcum、青霉属(Penicillium)、隔孢伏革菌属(Peniophora)、 根毛霉(Miizomucor)、根霉属(Iihizopus)或甚至源自松庆病菌属(Trametes)、孢子菌丝属(Sporotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)、枝孢属 (Cladosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Taleromyces、梭抱壳属(Thielavia)、腐质霉属(Humicola)、桩菇菌属(Paxillus)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。可获得大量关于这样的酶的比活性和Km的信息，如Wyss等1999 (App 1. Environ. Microbiol. 65 (2) 367-373)中的信息。总体上，曲霉属肌醇六磷酸酶被表征为5 μ M至20 μ M 的高Km值、57°C的最适温度和5. 5的最适pH——除了烟曲霉(Aspergillus fumigatus) (最适pH. = 6)，但具有范围从100至250U/mg非常低的比活性。某些源自其它真菌的肌醇六磷酸酶已显示令人感兴趣的性质，特别是高比活性， 如源自绒毛栓菌(Trametes pubescens)的肌醇六磷酸酶或源自隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的肌醇六磷酸酶(在WO 98/28408中分别是1200U/mg和1080U/mg)。枝孢菌属某种(Cladosporium sp.)具有令人感兴趣的肌醇六磷酸酶，其具有900U/mg的比活性和15. 2μ M的Km，但具有40°C的低最适温度。另外，来自蜡质菌属某种(Cei^poria sp.)的6-肌醇六磷酸酶具有11040U/mg的比活性。Lassen等，2001 (App 1. Environ. Microbiο 1. 67 (10) 4701 -4707发表了一些互补的信息，比较了来自担子菌，特别是隔孢伏革菌、蜡质菌某种、绒毛栓菌和黑曲霉的肌醇六磷酸酶的热稳定性；似乎所述酶具有从 550C (绒毛栓菌)到60°C (隔孢伏革菌)非常接近的Tms(酶具有50%活性时的温度)，但具有从15% (绒毛栓菌)到62% (隔孢伏革菌)变化大的残余活性(在醋酸钠， PH 5. 5中于80°C预温育60分钟而产生的活性百分比)。许多机构已提交了关于所述酶的专利申请，特别是Danisco/Genencor (WO 2001/012792, Penicillium subtilis ；WO 2003/038035，里氏木霉(Trichoderm本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·布莱萨，H·查尔德，M·戴尔库特，L·麦斯塔，B·文特尔，
申请(专利权)人：百奥麦瑟迪斯，
类型：发明
国别省市：
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