基于裂开型多肽为识别分子的检测方法技术

本发明专利技术涉及基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，具体地说是一种将可以识别目标物的完整肽链裂开为两条多肽作为识别分子检测目标物质含量的方法。以“裂开型”两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b作为识别分子，将识别分子与待测目标物特异性识别形成三维结构，形成夹心模式进而实现对待测目标物的定量检测。本发明专利技术提出的裂开型多肽对目标物具有良好的选择性识别性能，并且可以用做多种传感器的主要组成部分，有重要的科学价值和广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
基于裂开型多肽为识别分子的检测方法
本专利技术涉及基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，具体地说是一种将可以识别目标物的完整肽链裂开为两条多肽作为识别分子检测目标物质含量的方法。
技术介绍
多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽已作为一种高效的识别分子用于对目标物的识别与检测。多肽作为一种优秀的人工受体主要表现在以下几点：1.技术相对成熟；2，成本相对较低；3，易于修饰。与抗体、核酸适体一样，多肽也展示出了对离子、分子、蛋白质、细胞的特异性识别，并且表现出良好的性能。但是，现有基于多肽为识别分子的传感器多采用竞争性键合，修饰与测定过程较为复杂，难以用于“夹心法”反应，应用范围较窄，采用裂开型多肽为识别分子可以对两段肽链分别修饰，实现对目标物的一步识别并检测，极大的扩大了多肽在传感器领域的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于裂开型多肽为识别分子的检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，以“裂开型”两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b作为识别分子，将识别分子与待测目标物特异性识别形成三维结构，形成夹心模式进而实现对待测目标物的定量检测。所述“裂开型”两条短肽的整体为至少包括10个氨基酸的肽链；其中，“裂开”位点应在整条肽链的中心三分之一至三分之二处。所述两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b两端分别修饰，并应用于“夹心法”传感器。所述短肽a的C端(或N端)通过共价键或亲和反应进行修饰；所述短肽b的N端(或C端)通过荧光标记、共价修饰酶或共价键进行修饰。所述“裂开型”两条短肽的整体肽为对离子、小分子、多糖、蛋白质或细菌可识别的多肽；所述目标物质为离子、小分子、多糖、蛋白质或细菌。所述“裂开型”两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b序列分别为a、GVHRLANGK与b、NWGEAFSA，a’、FSAGVHRLANGK与b’、biotin-NWGEA或a”、RLANGK、；b”、NWGEAFSAGVH；进而特异性识别单增李斯特菌。上述，“裂开型”多肽包括将完整的肽链在适当位点分裂后形成的片段a和片段b，二者与目标物会发生特异性结合。所述的完整的肽链具有对目标物的特异性识别能力；所述的适当位点是指在该位点对完整的肽链进行分裂后的多肽仍能保持对目标物的特异性识别能力；所述的片段a和片段b在没有目标物存在时不会发生相互作用，当目标物存在时，片段a和片段b与目标物发生特异性结合。片段a的C端(或N端)可以通过共价键修饰在电极表面，或者通过亲和反应修饰于磁珠、磁纳米颗粒上，达到固定的或者分离的目的。片段b的N端(或C端)可以进行荧光标记、共价修饰酶以及共价修饰电化学活性基团，达到对目标物进行识别的目的。目标物存在时，裂开的两条肽链与目标物结合形成特殊的三维结构。片段b上的活性物质可以直接或间接的引起电化学信号、荧光信号的改变，信号改变的大小与目标物的浓度是成比例的，进而实现对目标物浓度的测定。所述共价键修饰在电极表面为通过酰胺键、金－硫键修饰在电极表面。所述电极为玻碳电极、石墨电极、金属电极、ITO导电玻璃电极、丝网印刷电极或纸芯片电极。所述亲和反应为将生物素、亲和素分别修饰于肽链和磁珠(或磁纳米颗粒)上，生物素和亲和素发生亲和反应，将肽链连接在磁珠(或磁纳米颗粒)上。所述荧光标记为将FITC、FAM、罗丹明、AFC、AMC、Rox、Sulforhodamine101、5‐TAMRA、EDANSTexasRed标记在肽链上或者将肽链进行量子点标记、金纳米标记；共价修饰酶为将过氧化氢酶、磷酸酯酶修饰在肽链上；共价修饰电化学活性基团为修饰二茂铁在肽链上。所述电化学信号指氧化还原物质在电极表面产生的电流信号或电活性物质在离子选择性膜上产生的电位响应；荧光信号为荧光标记物质在荧光检测器上信号的改变。本专利技术检测原理为：片段a或者片段b不能单独识别目标物，片段a与片段b同时存在时才可以识别目标物并折叠成螺旋结构，片段a与片段b的两端可以修饰不同的标记物来扩大该方法的适用性。依本专利技术方法的检测原理应用的主要模式包括“夹心”反应模式、竞争性键合反应模式。本专利技术优点在于：1.本专利技术提出的裂开型多肽易于合成，而且保留了对目标物的选择性识别性能。2.本专利技术利用裂开型多肽可以对目标物进行选择性识别，裂开的两段肽链可以分别作为捕获与信号探针，只有在目标物存在时，两段探针同时作用于目标物，可以达到筛选并检测的目的。3.本专利技术可应用于多种检测方法。凭借多肽易标记的特点，可以对多肽进行固定、修饰，而且不会对多肽的识别性能产生影响，可以用于多种检测装置，这极大的拓展了多肽在传感器领域的应用。附图说明图1为本专利技术实施例中裂开型多肽为识别分子的电位传感器检测单增李斯特菌的原理示意图。图2为本专利技术实施例1中电极对过氧化氢酶催化TMB产物响应的标准曲线图。图3为本专利技术实施例2中荧光检测FITC标记的识别李斯特菌的多肽标准曲线图。具体实施方式以下通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。具体为对裂开型多肽进行固定或者标记，在目标物存在时，裂开型的两条多肽与目标物质相互作用，形成复合物，并通过多肽上的荧光物质、酶直接或者间接地得到光电信号，不同浓度的目标物引起的电信号不同，从而实现对目标物的检测。本专利技术提出的裂开型多肽对目标物具有良好的选择性识别性能，并且可以用做多种传感器的主要组成部分，有重要的科学价值和广阔的市场前景。实施例1基于裂开型多肽为识别分子的电位传感器检测单增李斯特菌。其测定步骤如下：1)以肽链GEAFSAGVHRLANG作为识别单增李斯特菌的完整肽链，由于其识别过程会形成三维结构，将此肽链裂开成a、b两条肽链后，其识别过程仍可能形成三维螺旋结构与目标物相互作用。分别合成两条肽链，为增加肽链的亲水性、易于对肽链进行修饰，在两端增加了不同的氨基酸。然后对两条肽链修饰生物素。其序列为：a，GVHRLANGK-biotin；b，biotin-NWGEAFSA。为验证不同位点对识别的影响，又分别合成了四条由不同位点裂开的肽链a’，FSAGVHRLANGK-biotin；b’，biotin-NWGEA；a”，RLANGK-biotin；b”，biotin-NWGEAFSAGVH。2)如图1所示，将肽链a，a’，a”通过亲和反应连接在磁珠上，肽链b，b’，b”通过亲和反应连接辣根过氧化氢酶(HRP)。肽链a，a’，a”，b，b’，b”的浓度均为10-3M，磁珠100微升，辣根过氧化物酶的浓度为1U/mL。3)如图1所示，将上述浓度的肽链a、b、肽链a’、b’或肽链a”、b”分别与不同浓度的单增李斯特菌同时加入烧杯中，两条肽链与单增李斯特菌发生特异性结合，静置1小时以使其能反应完全。使用磁铁对磁珠进行分离，分离后的磁珠通过肽链连接了单增李斯特菌，并且在肽链b上连接了HRP酶，将反应后的溶液使用移液枪移走。4)电极制作。电极膜组成为：171mg聚氯乙烯，171mg邻-硝基苯辛醚，10mM/kg四苯基硼酸钠。称取电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，其特征在于：以“裂开型”两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b作为识别分子，将识别分子与待测目标物特异性识别形成三维结构，形成夹心模式进而实现对待测目标物的定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，其特征在于：以“裂开型”两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b作为识别分子，将识别分子与待测目标物特异性识别形成三维结构，形成夹心模式进而实现对待测目标物的定量检测。2.按权利要求1所述基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，其特征在于：所述“裂开型”两条短肽的整体为至少包括10个氨基酸的肽链；其中，“裂开”位点应在整条肽链的中心三分之一至三分之二处。3.按权利要求1所述基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，其特征在于：所述两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b两端分别修饰，并应用于“夹心法”传感器。4.按权利要求3所述基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，其特征在于：所述短肽a的C端(或N端)通过共价键或亲和反应进行修饰；所述短肽b的N端(或C端)通过荧光标记、共价修饰酶或共价键...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁家旺，吕恩广，秦伟，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37