检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组，包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的引物，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.8所示。本发明专利技术属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对饮用水中上述四种致病菌的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于检测饮用水标准中的致病菌指标。

Detection of four pathogenic bacteria in drinking water by four fold fluorescent PCR primer set, probe group, kit and method

The invention discloses a four PCR primer group for detecting four pathogenic bacteria in drinking water, including primers for coliform, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, and Clostridium perfringens, as shown by Seq.ID No.1 to Seq.ID No.8. The invention belongs to the field of genetic engineering detection technology. The primers and probes do not interfere with each other. It can only amplify the specific target sequence and stimulate the fluorescence signal. The non target sequence without amplification and fluorescence signal can realize the accurate detection of the four kinds of pathogenic bacteria in the drinking water, which has good specificity and standard error. It is suitable for detecting pathogenic bacteria in drinking water standard.

【技术实现步骤摘要】
检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法
本专利技术属于基因工程检测
，尤其涉及检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法。
技术介绍
民以食为天，食品安全是社会和谐的基础支柱，而饮用水质量安全更是重中之重。近年来，随着疾控预防的研究深入，国家标准、行业标准，各级监抽细则，均明确了饮用水中致病菌的检测指标。当前，针对普通饮用水，该类指标主要包括大肠菌群Coliformbacteria、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，针对饮用矿泉水，该类指标主要包括大肠菌群Coliformbacteria、粪链球菌Enterococcusfaecalis、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens，均要求零检出。标准方法上，上述致病菌的检测均采用传统培养方法，存在试剂和培养基种类多达十多种、全程基本为手工操作、阴性检测时间至少2d和阳性检测时间可长达5至10d、菌落观察鉴别和生化反应鉴定受人为因素影响较大等情况。随着分子生物学在微生物学中的深入运用，使用PCR技术检测饮用水中致病菌也成为可选方法之一。第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步。相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。涉及致病菌检测的PCR技术，已有较广泛的报道，但多为普通PCR方法和单重荧光PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如专利申请200410091917.3《多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法》、200810071105.0《食源性致病菌的检测方法》、201410057135.1《一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法》等。这些专利申请在检测样品和检测对象上与饮用水标准要求相差较大，且存在试剂种类繁多、操作步骤复杂等问题。因此，提供一种适于标准要求和便于操作判定的饮用水中致病菌检测的多重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法具有重要意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术对大肠菌群Coliformbacteria、粪链球菌E.faecalis、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、产气荚膜梭菌C.perfringens设计特异性的引物组和探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对饮用水中致病菌的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点。首先明确检测对象Coliformbacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens的分类学地位。由于大肠菌群是卫生学概念而非分类学概念，以学术报道和日常检测看，基本以大肠埃希氏菌Escherichiacoli、费氏柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii、产气肠杆菌Enterobacteraerogenes、阴沟肠杆菌Enterobactercloacae为主要代表株，因此在设计鉴别大肠菌群的引物和探针时，以准确鉴别上述4种菌为准。另据伯杰氏系统细菌学手册(Taxonomicoutlineoftheprokaryotes,Bergey’smanualofsystematicbacteriology,secondedition,release5.0,May2004)，E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens等在分类学上已有明确定位，可进行针对性鉴定。其次建立前处理方法：参考GB4789《食品安全国家标准食品微生物学检验》系列标准和GB8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》及日常检测经验，结合本方法检出限，设立两种前处理方法以供选用：若预计待测水样的污染程度较高，可选择滤膜洗脱法处理后直接检测，缩短总检测时间至1d；若预计待测水样的污染程度较低，可选择滤膜增菌法处理后再行检测，提高检出效率，总检测时间约2–3d。进而确立检验方法：在细菌分类学领域，核糖体16SrRNA基因为细菌基因组的高度保守序列，普遍用于鉴定细菌属、种。首先进行大肠菌群的特异性引物探针设计，检索NCBI的Genbank后获得Escherichiacoli、Citrobacterfreundii、Enterobacteraerogenes、Enterobactercloacae核糖体16SrRNA基因序列数十条，首先用Lasergene7.1.0中的MegAlign软件比对出保守序列，再通过Oligo7.0.1和NCBI的Primer-Blast验算后进行筛选，专利技术人发现在特定位点可设计该4种菌的一对通用引物和一条通用探针，该探针选用NFQ-MGB荧光淬灭基团，相对TAMRA、BHQ等特异性更强，能有效避免单碱基差异带来的非特异性扩增，确保鉴定结果准确。检索NCBI的Genbank后获得E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens核糖体16SrRNA基因序列数十条，首先用Lasergene7.1.0中的MegAlign软件比对出保守序列，再通过Oligo7.0.1和NCBI的Primer-Blast验算后进行筛选，专利技术人发现其不适用于一对通用引物和三条特异探针的设计方式，可通过设计三对通用引物和三条特异探针的方式进行检测，并同样选用NFQ-MGB荧光淬灭基团，最终通过实践进行验证。上述引物和探针的检测位点，以NCBI的Genbank中相应核糖体16SrRNA序列举例如下：(1)Escherichiacoli序列MF784285.1的715bp至793bp；(2)Citrobacterfreundii序列M59291.1的773bp至851bp；(3)Enterobacteraerogenes序列AB099402.1的741bp至819bp；(4)Enterobactercloacae序列AF157695.1的727bp至805bp；(5)E.faecalis序列AB012212.1的748bp至829bp；(6)P.aeruginosa序列AF157689.1的927bp至1023bp；(7)C.perfringen本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组，其特征在于：包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的四对引物：大肠菌群的上游引物为Seq.ID No.1，下游引物为Seq.ID No.2；粪链球菌的上游引物为Seq.ID No.3；下游引物为Seq.ID No.4；铜绿假单胞菌的上游引物为Seq.ID No.5；下游引物为Seq.ID No.6；产气荚膜梭菌的上游引物为Seq.ID No.7；下游引物为Seq.ID No.8。

【技术特征摘要】
1.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组，其特征在于：包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的四对引物：大肠菌群的上游引物为Seq.IDNo.1，下游引物为Seq.IDNo.2；粪链球菌的上游引物为Seq.IDNo.3；下游引物为Seq.IDNo.4；铜绿假单胞菌的上游引物为Seq.IDNo.5；下游引物为Seq.IDNo.6；产气荚膜梭菌的上游引物为Seq.IDNo.7；下游引物为Seq.IDNo.8。2.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR探针组，其特征在于：包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的四重荧光PCR探针组：大肠菌群的探针为Seq.IDNo.9，5’端用FAM荧光激发基团修饰；粪链球菌的探针为Seq.IDNo.10，5’端用VIC荧光激发基团修饰；铜绿假单胞菌的探针为Seq.IDNo.11，5’端用NED荧光激发基团修饰；产气荚膜梭菌的探针为Seq.IDNo.12，5’端用Cy5荧光激发基团修饰，所述探针3’端分别用NFQ-MGB荧光淬灭基团修饰。3.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物组、权利要求2所述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照、阴性对照。4.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为用权利要求1所述的引物组进行扩增，并用权利要求2所述的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为105copies/μL级。5.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光P...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙端方，罗绍楠，左泽彦，董睿，李春宇，田志强，张谦，黄家瑞，
申请(专利权)人：贵州省产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：贵州,52