沙门氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了沙门氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液组成，以上7种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的6条引物对应沙门氏菌特异性靶基因序列的8个区段，通过加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全和医药卫生领域中的沙门氏菌快速检测。另外，本发明专利技术为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对沙门氏菌的快速检测，具有广泛的应用前景。

Rapid detection kit for Salmonella dry powder LAMP

The present invention discloses a rapid detection kit for Salmonella dry powder LAMP. The kit consists of dry powder detection reagent, complex solution, positive control dry powder, negative control dry powder, sealing solution, color solution and lysate, and the above 7 reagents are respectively placed in the container. The 6 primers used in this kit correspond to 8 sections of the specific target gene sequence of Salmonella. By adding color solution, the color difference between yin and Yang is obvious. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, easy operation and simple results. It is suitable for fast detection of Salmonella in food safety and medical and health fields. Test. In addition, the invention is a testing reagent for dry powder, easy to transport at normal temperature, easy to use, fast, without special instruments, reduce cost and broaden the range of product application, and is more suitable for rapid detection of Salmonella at the base of field and remote areas, and has wide application foreground.

【技术实现步骤摘要】
沙门氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒
本专利技术涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化沙门氏菌核酸快速检测试剂盒。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella)是肠杆科中一种重要的人畜共患的革兰氏阴性菌病原菌。动物源性沙门氏菌易引起摄食者急性腹泻，甚至暴发食物中毒，导致胃肠炎、伤寒以及副伤寒，其中肉类和家禽类是沙门氏菌传播的主要媒介。近年来，沙门氏菌在全球范围内引起的危害呈上升趋势，在公共卫生学上，在食物中如何快速、准确、特异地检测沙门氏菌存在与否，具有重要意义。由于沙门氏菌血清型较多，其各类生化反应复杂，目前已建立了多种沙门氏菌检测方法，其中主要是采用传统培养基法，包括病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动化鉴定方法。另外也有酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增技术等分子生物学检测方法，这些技术试图突破传统的形态学、生化反应等传统模式，不需要对沙门氏菌进行分离提纯，而直接用样品或者样品的增菌液检测，使得检测向准确、快速和低成本方向发展。LAMP技术是由2000年由日本研究人员Notomi等开发的一种新型的核酸体外恒温扩增特异片段的分子检测技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量PCR。而在实际的应用中，如果在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易造成由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是BstDNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法作为非标方法，尚未在食品安全、医药等领域推广开来，已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式均无提及，加之市场上基于LAMP技术的沙门氏菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有沙门氏菌的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化沙门氏菌快速检测试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足相关食品的生产、流通中各个环节的快速检测的需求。本专利技术所采取的技术方案是：一种沙门氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：沙门氏菌-F3：cagttagaattaggtcttgacg沙门氏菌-B3：cttttcgtggcaaaaatcct沙门氏菌-FIP：tccgcgacacgttctgaaccctctattgtcaccgtggtcc沙门氏菌-BIP：tgccgatttgaaggccggtacagtacgcttcgccgttc沙门氏菌-LF：cctttggtaataacgataaactgg沙门氏菌-LB：tattgatgcggatgccgcgcg。一种沙门氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其LAMP引物组如上所示。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。冻干复合保护剂优选含3％～5％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白。特别的，冻干复合保护剂为：3％海藻糖(w/v)、0.01％甘氨酸(w/v)、0.1％牛血清白蛋白。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：10～20mmol/LTris-HClpH8.3、1mmol/LEDTA、0.3～1％SDS。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为无菌石蜡油。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照干粉为提纯的沙门氏菌基因组DNA制成的冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非沙门氏菌基因组DNA制成的冻干粉。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，，使用方法包括如下步骤：(1)取25g待检样品氯化镁孔雀绿增菌液(RV)，增菌时间为10h±2h，对增菌液中的菌体富集用于LAMP快速检测；(2)取以上1～2mL增菌液6000r/min离心，去上清；(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；(4)取n个冻干粉管(n＝待检测样品数+1管阳性对照+1管阴性对照)，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的沙门氏菌基因组DNA作为阳性对照，以经无菌超纯水溶解的非沙门氏菌基因组DNA作为阴性对照，后按照一定比例加入显色液，充分混匀后加入封闭液，设置65℃恒温反应；(5)反应后结果判读：反应结束后，建议在自然光线充足的环境条件下，将样品置于白色背景下观察结果，阴性对照反应管呈淡橙色，阳性对照反应管呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。本专利技术的有益效果是：本试剂盒基于LAMP技术快速检测沙门氏菌，是利用3对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶，特异性识别靶序列上的8个独立区域，并实现在恒温条件下(60～65℃)进行链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过热变性过程获得单链模板、检测时间长、易污染以及成本高等缺点，同时该方法在温和温度条件进行，操作简便，对检测人员的技术素质要求也低，便于对大样本实现成本低廉的快速筛选。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沙门氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：沙门氏菌‑F3：cagttagaattaggtcttgacg沙门氏菌‑B3：cttttcgtggcaaaaatcct沙门氏菌‑FIP：tccgcgacacgttctgaaccctctattgtcaccgtggtcc沙门氏菌‑BIP：tgccgatttgaaggccggtacagtacgcttcgccgttc沙门氏菌‑LF：cctttggtaataacgataaactgg沙门氏菌‑LB：tattgatgcggatgccgcgcg。

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：沙门氏菌-F3：cagttagaattaggtcttgacg沙门氏菌-B3：cttttcgtggcaaaaatcct沙门氏菌-FIP：tccgcgacacgttctgaaccctctattgtcaccgtggtcc沙门氏菌-BIP：tgccgatttgaaggccggtacagtacgcttcgccgttc沙门氏菌-LF：cctttggtaataacgataaactgg沙门氏菌-LB：tattgatgcggatgccgcgcg。2.一种沙门氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其LAMP引物组如权利要求1所示。3.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。4.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。5.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。6.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：周杨，吴清平，万强，卢勉飞，蔡芷荷，何天文，薛仁军，
申请(专利权)人：广东环凯微生物科技有限公司，广东环凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44