SmartBac杆状病毒表达系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种SmartBac杆状病毒表达系统及其应用。该系统可包括受体质粒(含片段A或者含片段B和C)和供体质粒(含片段D)；片段A含启动子、蛋白酶编码序列、蛋白酶切割位点、待表达目的物编码基因的插入区和终止序列；片段B含启动子、蛋白酶编码序列和终止序列；片段C含启动子、待表达目的物编码基因的插入区和终止序列；片段D含启动子、待表达目的物编码基因的插入区和终止序列。本发明专利技术还提供三种克隆的策略以实现分子量小于600kDa的蛋白质复合物表达、分子量大于600kDa的蛋白质复合物表达及高效筛选最适添加纯化标签的亚基。本发明专利技术对于在昆虫细胞中重组表达组分复杂、分子量较大的蛋白质复合物具有重要意义。

SmartBac baculovirus expression system and its application

The invention discloses a SmartBac baculovirus expression system and its application. The system can include receptor plasmids (including fragment A or fragment B and C) and donor plasmid (including fragment D), fragment A containing promoter, protease coding sequence, protease cutting site, insertion region and terminating sequence of the encoded gene to be expressed, the fragment B contains promoter, encoding sequence of egg white enzyme and terminating sequence; fragment C contains priming. The insertion region and the termination sequence of the coding gene of the target gene and the target gene to be expressed; the fragment D contains the promoter and the insertion region and the termination sequence of the target gene to be expressed. The invention also provides three cloning strategies for the expression of protein complexes with molecular weight less than 600kDa, the expression of protein complexes with molecular weight greater than 600kDa, and the efficient screening of the subunits of the most suitable and purified label. The invention has important significance for recombination and expression of complex protein components with large molecular weight in insect cells.

【技术实现步骤摘要】
SmartBac杆状病毒表达系统及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种杆状病毒表达系统及其应用，具体涉及一种新型的在昆虫细胞中同时表达多种蛋白质的杆状病毒表达系统SmartBac系统及其在表达超大分子复合物上的应用。
技术介绍
杆状病毒表达系统(BaculovirusExpressionSystem，BVES)是在昆虫细胞中高效表达外源蛋白质的用力工具，具有安全性好、表达水平高、可进行翻译后加工等优点。由于杆状病毒的基因组庞大，外源基因的克隆不能通过酶切连接的方法直接插入，所以人们对杆状病毒基因组进行改造，并构建与之相匹配的转移载体，使两者重组为能够感染昆虫细胞的含外源基因的重组杆状病毒。在目前广泛使用的BactoBac系统中，杆状病毒穿梭载体(Bacmid)既可以在大肠杆菌中复制，又可以感染鳞翅目昆虫细胞，其在大肠杆菌中可以与含外源基因的匹配转移载体发生Tn7位点特异性重组。重组得到的杆状病毒穿梭载体能在大肠杆菌中高效复制，被提纯后可用于转染昆虫细胞。杆状病毒基因组容量大，可以在转移载体上插入多个开放阅读框(ORF，OpenReadingFrame)，继而使得到的重组杆状病本文档来自技高网...

【技术保护点】
SmartBac杆状病毒表达系统，为如下任一：(A)SmartBac杆状病毒表达系统A，包括受体质粒和供体质粒；所述受体质粒和所述供体质粒能够发生重组融合为一个质粒；所述受体质粒为受体质粒甲和/或受体质粒乙；所述受体质粒甲上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含：启动子A、蛋白酶的编码基因序列、所述蛋白酶的切割位点识别序列、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列A；所述受体质粒乙上含有DNA片段B和DNA片段C；所述DNA片段B自上游到下游依次包含：启动子B、所述蛋白酶的编码基因序列，以及终止序列B；所述DNA片段C自上游到下游依次包含：启动子C、待表达目的物的编码基因的...

【技术特征摘要】
1.SmartBac杆状病毒表达系统，为如下任一：(A)SmartBac杆状病毒表达系统A，包括受体质粒和供体质粒；所述受体质粒和所述供体质粒能够发生重组融合为一个质粒；所述受体质粒为受体质粒甲和/或受体质粒乙；所述受体质粒甲上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含：启动子A、蛋白酶的编码基因序列、所述蛋白酶的切割位点识别序列、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列A；所述受体质粒乙上含有DNA片段B和DNA片段C；所述DNA片段B自上游到下游依次包含：启动子B、所述蛋白酶的编码基因序列，以及终止序列B；所述DNA片段C自上游到下游依次包含：启动子C、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列C；所述供体质粒上含有DNA片段D；所述DNA片段D自上游到下游依次包含：启动子D、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列D；所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段；(B)SmartBac杆状病毒表达系统B，包括受体质粒和供体质粒；所述受体质粒和所述供体质粒能够发生重组融合为一个质粒；所述受体质粒上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含：启动子A、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列A；所述供体质粒为供体质粒甲和/或供体质粒乙；所述供体质粒甲上含有DNA片段B；所述DNA片段B自上游到下游依次包含：启动子B、蛋白酶的编码基因序列、所述蛋白酶的切割位点识别序列、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列B；所述供体质粒乙上含有DNA片段C和DNA片段D；所述DNA片段C自上游到下游依次包含：启动子C、所述蛋白酶的编码基因序列，以及终止序列C；所述DNA片段D自上游到下游依次包含：启动子D、待表达目的物的编码基因的插入区，以及终止序列D；所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段；(C)SmartBac杆状病毒表达系统C，包括所述SmartBac杆状病毒表达系统A或所述SmartBac杆状病毒表达系统B中的所述受体质粒；(D)SmartBac杆状病毒表达系统D，与所述SmartBac杆状病毒表达系统A或所述SmartBac杆状病毒表达系统B或所述SmartBac杆状病毒表达系统C相比，差别仅在于：将其中的所述待表达目的物的编码基因的插入区替换为两两之间由所述蛋白酶的切割位点识别序列间隔开来的若干个插入区，每个插入区用于插入一个所述待表达目的物的编码基因。2.根据权利要求1所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段A中，在所述待表达目的物的编码基因的插入区和所述终止序列A之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段B中，在所述蛋白酶的编码基因序列和所述终止序列B之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段D中，在所述待表达目的物的编码基因的插入区和所述终止序列D之间自上游到下游还依次含有所述蛋白酶的切割位点识别序列和荧光蛋白的编码基因序列。3.根据权利要求1或2所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述受体质粒和所述供体质粒上均含有位点特异性重组酶的识别序列；进一步地，所述位点特异性重组酶为Cre重组酶；和/或所述受体质粒中含有非条件型复制起点；所述供体质粒中含有条件型复制起点；进一步地，所述非条件型复制起点为p15A复制起点；所述条件型复制起点为R6Kγ复制起点；和/或所述受体质粒和所述供体质粒上含有不同的抗性筛选标记基因。4.根据权利要求1-3中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述启动子A为p6.9启动子；所述启动子B为GP64启动子；所述启动子C为p6.9启动子；所述启动子D为p10启动子。5.根据权利要求1-4中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述待表达目的物的编码基因的插入区自上游到下游依次含有多克隆位点1、LacZ-α表达盒和多克隆位点2；进一步地，在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，在所述DNA片段D中，所述待表达目的物的编码基因的插入区中的所述多克隆位点1和所述多克隆位点2之间还含有PUC复制起点。6.根据权利要求1-5中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：所述蛋白酶为TEV蛋白酶。7.根据权利要求6所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段A自上游到下游依次由p6.9启动子、N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、Twin-Strep标签编码序列、肠激酶切割位点的识别序列、多克隆位点1、LacZ-α表达盒、多克隆位点2、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、荧光蛋白的编码基因序列和SV40pA信号序列连接而成；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段B自上游到下游依次由GP64启动子、N端被HA标记的TEV蛋白酶的编码基因序列、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、荧光蛋白的编码基因序列和IE1ter信号序列连接而成；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段C自上游到下游依次由p6.9启动子、Twin-Strep标签编码序列、肠激酶切割位点的识别序列、多克隆位点1、LacZ-α表达盒、多克隆位点2和SV40pA信号序列连接而成；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段D自上游到下游依次由p10启动子、10×His标签编码序列、肠激酶切割位点的识别序列、多克隆位点1、PUC复制起点、LacZ-α表达盒、多克隆位点2、TEV蛋白酶切割位点的识别序列、荧光蛋白的编码基因序列和HSVtkpA信号序列连接而成。8.根据权利要求7所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段A的序列为SEQIDNo.1的第1235-3971位或者为SEQIDNo.2的第1235-3971位；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段B的序列为SEQIDNo.3的第1208-3252位或者为SEQIDNo.4的第1208-3249位；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段C的序列为SEQIDNo.3的第3306-4521位或者为SEQIDNo.4的第3303-4518位；在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述DNA片段D的序列为SEQIDNo.5的第259-3188位或者为SEQIDNo.6的第259-3188位。9.根据权利要求8所述的SmartBac杆状病毒表达系统，其特征在于：在所述SmartBac杆状病毒表达系统A中，所述受体质粒甲为4V1G质粒和/或4V1R质粒；所述4V1G质粒的全序列为SEQIDNo.1；所述4V1R质粒的全序列为SEQIDNo.2；所述受体质粒乙为5V1TG质粒和/或5V1TR质粒；所述5V1TG质粒的全序列为SEQIDNo.3；所述5V1TR质粒的全序列为SEQIDNo.4；所述供体质粒为4V2G质粒和/或4V2R质粒；所述4V2G质粒的全序列为SEQIDNo.5；所述4V2R质粒的全序列为SEQIDNo.6。10.生物材料、应用或方法；所述生物材料为如下任一：(a)DNA片段组；所述DNA片段组由权利要求1-9任一中所述的DNA片段A、所述DNA片段B、所述DNA片段C和所述DNA片段D中的全部或部分组成；(b)哺乳动物细胞表达系统，是通过将权利要求1-9中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统中的所述受体质粒和所述供体质粒中被昆虫细胞识别的用于表达目的蛋白的启动子、终止序列替换为能被哺乳动物细胞识别的启动子和终止序列后得到的；(c)DNA片段组；所述DNA片段组由步骤(b)所述哺乳动物细胞表达系统中的所述DNA片段A、所述DNA片段B、所述DNA片段C和所述DNA片段D中的全部或部分组成；所述应用为所述生物材料或权利要求1-9中任一所述的SmartBac杆状病毒表达系统在同时表达n个目的物中的应用；所述目的物为蛋白或蛋白亚基或蛋白片段或多肽或多肽片段；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟宇佳，孙飞，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11