包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体、表达细胞及药物制造技术

本发明专利技术提供了一种包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体、表达细胞及药物，所述包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，所述胞内结构域选自C3aR胞内结构域或与C3aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域。本发明专利技术的嵌合抗原受体可以提高T17细胞亚群，消除调节T细胞的免疫抑制的作用，可以显著提高肿瘤靶细胞的体外杀伤效率，可显著改善第二代CAR T细胞对肿瘤的杀伤效果，为CAR‑T细胞治疗领域提供一种新的思路和选择。

Chimeric antigen receptor, lentivirus carrier, expression cell and drug containing C3aR intracellular domain

The invention provides a chimeric antigen receptor, containing the cytoplasmic domain of C3aR lentiviral expression vector, cells and drugs, comprising a chimeric antigen receptor C3aR intracellular domain, which contains binding to the extracellular domain, transmembrane domain antigen and at least one intracellular domain, the the intracellular domain of C3aR from intracellular domain or in tandem with the cytoplasmic domain of C3aR signaling region of the cytoplasmic domain. Chimeric antigen receptor of the invention can improve T17 cell subsets, eliminate immune regulatory T cells inhibit tumor cells can significantly improve the in vitro killing efficiency, can improve the killing effect of the second generation CAR T cells to tumor significantly, to provide ideas and choose a new CAR T cell therapy.

【技术实现步骤摘要】
包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体、表达细胞及药物
本专利技术属于肿瘤的细胞免疫治疗
，具体涉及一种包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体，还涉及包含编码C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体的核酸和应用。
技术介绍
嵌合抗原受体(CAR,ChimericAntigenReceptors)T细胞是有望治愈肿瘤的里程碑事件,CAR-T技术是应用基因改造技术，将一段识别肿瘤抗原的单链抗体(singlechainfragmentvariable,scFv)和胞内活化基序重组基因转染至T淋巴细胞上以达到更好的识别及杀伤肿瘤的作用。CAR-T分子通常包括胞外绞链区、跨膜区和胞内信号区。其中胞外绞链区是由单链抗体的重链和轻链可变区通过一条肽段连接而形成；跨膜区则主要来自于如CD8、CD28或4-1BB等分子的跨膜区；胞内信号区则主要来自于CD28、4-1BB、CD3zeta、CD27或OX-40等T细胞传导信号分子的胞内段嵌合体。高亲合力，高特异性的scFv决定CAR-T靶向某种抗原，一旦结合抗原，CAR的胞内段会传输活化以及共刺激信号给T细胞，激活T细胞进而有效靶向杀伤肿瘤细胞。T细胞的激活需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-I分子结合为活化的第一信号,决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应配体结合为活化的第二信号,决定T细胞增殖。简而言之,CAR-T细胞通过抗原-抗体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别,然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。CAR分子的结构设计经历多代的研究发展。第一代CAR分子的结构包含识别肿瘤细胞表面抗原的scFv、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3zeta的胞内结构域。由于第一代CAR的信号域是单一信号分子，缺乏共刺激信号，第一代CAR-T细胞在体内存活时间短，对肿瘤细胞的杀伤力弱，疗效并不理想。为充分模拟人体内T淋巴细胞活化的双信号模型，增强第一代CAR分子激活T细胞的能力，开始出第二代CAR，第二代CAR主要是在胞内段结构域加入1个共刺激信号域，目前已经报导的共刺激配体主要集中在特异性结合T细胞上的关联共刺激分子的抗原呈递细胞，包括CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BB、OX-40、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HEVM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、HVEM，进而增强其对肿瘤抗原的识别能力和T淋巴细胞杀伤力(MaQ,GomesEM,LoAS,etal.Advancedgenerationanti-prostatespecificmembraneantigendesignerTcellsforprostatecancerimmunotherapy[J].Prostate,2014,74(3)：286–296)。Savoldo等为6例B细胞淋巴瘤患者构建2种抗CD19-CAR-T细胞，一种CAR的信号域仅有单一信号分子ζ链(第一代CAR-T)，另一种则同时加入了ζ链和共刺激分子CD28(第二代CAR-T)，该研究体外培养及检测结果表明，在体外增殖、细胞因子分泌水平方面，含有CD28信号链的二代CAR-T细胞表现出显著优势。将这2种细胞同时回输入患者体内，定期检测细胞数量，结果表明，二代CAR-T细胞体内增殖速度及存活时间均优于一代CAR-T细胞(SavoldoB，RamosCA，LiuE，eta1.CD28costimulationimprovesexpansionandpersistenceofchimericantigenreceptormodifiedTcellsinlymphomapatients[J].ClinInvest，2011，121(5)：1822–1826)。同样的研究也证实了含有CD137(4-1BB)信号链的二代CAR-T比一代CAR-T有更强的杀伤效应和持久性(MaudeSL,FreyN,ShawPA,etal.ChimericantigenreceptorTcellsforsustainedremissionsinLeukemia.NEngLJM.2014；371:1507-1517)。虽然CAR-T细胞临床试验获得了疗效,但还存在进一步改善的空间，如进一步增强其激活、细胞杀伤功能，从而提高CAR-T疗法的疗效。第三代CAR-T则在第一代基础上整合了2个或2个以上共刺激分子信号，共刺激信号的不同组合可能影响CAR-T细胞的功能和疗效,研究表明,并不是所有的第三代CAR-T都比第二代好。第三代CAR-T已被用于套细胞淋巴瘤(MCL)及滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)临床试验，但其并未显示出比第二代更优的临床结果。目前在急性白血病临床应用上较为成功的主要是第二代CAR-T技术，转染的一个共刺激分子主要是CD28或CD137(4-1BB)，另一个共刺激分子则是CD3zeta。由此可见，现有技术中CAR的结构设计并不是十分成熟，需要进一步针对增强T细胞杀伤功能、增强Th17细胞亚群，消除调节性T细胞的免疫抑制等方面对CAR分子进行改良。在固有免疫应答及适应性体液免疫应答过程中，补体系统具有重要的生物学效应。体内补体固有成分在生理情况下以前体酶的形式存在，被激活后可产生活性分子片段，如C3a、C4a、C5a，从而发挥生物免疫学效应。在此活化过程中，最终合成攻膜复合物，攻击微生物或其他靶细胞，从而造成靶细胞的溶解破裂。而这些补体裂解产物主要通过与补体受体(CR)：C3aR、C5aR结合来发挥免疫学功能。补体与CD4+T细胞间存在密切的相互调节关系，C3aR补体途径促进Th17分化，同时抑制调节性T细胞的产生。用C3aR与其他共刺激分子共同组合用于嵌合抗原受体的构建，更无法预期构建后的嵌合抗原受体效果如何。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供包含C3aR胞内结构域胞的嵌合抗原受体；本专利技术的目的之二在于提供包含C3aR胞内结构域胞的嵌合抗原受体的慢病毒载体；本专利技术的之三在于提供所述包含C3aR胞内结构域胞的嵌合抗原受体或所述慢病毒载体在制备包含C3aR胞内结构域胞的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用；本专利技术的目的之四在于提供利用所述包含C3aR胞内结构域胞的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体制备的表达包含C3aR胞内结构域胞的嵌合抗原受体的免疫细胞；本专利技术的目的之五在于提供所述包含C3aR胞内结构域胞的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体靶向肿瘤细胞的药物中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，所述胞内结构域选自C3aR胞内结构域或与C3aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域。其中，“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。而所述的至少一个胞内结构域是指C3aR胞内结构域，或与C3aR胞内结构域串联的其它信号传递区域如CD3ζ、CD28、4-1BB等的胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其特征在于，所述胞内结构域选自C3aR胞内结构域或与C3aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域。

【技术特征摘要】
1.一种包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其特征在于，所述胞内结构域选自C3aR胞内结构域或与C3aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，与C3aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域选自CD3ζ、CD28、4-1BB中的一种或多种。3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域还包括CD3ζ胞内结构域，所述C3aR胞内结构域配置在CD3ζ胞内结构域的C末端侧。4.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域为自N末端侧开始依次连接的4-1BB胞内结构域、CD3ζ胞内结构域和C3aR胞内...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜欣，翁建宇，赖沛龙，陈晓梅，
申请(专利权)人：广东省人民医院广东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：广东,44