一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法，该方法包括：(1)设计cLHRH基因；(2)对设计的基因序列进行合成、退火、酶切、连接，然后再转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；(3)制备原始菌液；(4)乳糖诱导；(5)低温渗透休克分离纯化；(6)采用10×醛化盐水醛化；(7)配苗。该制备方法简单，成本低，在整个制备过程不涉及任何对动物具有潜在的有毒、有害或难以降解的物质，制得的疫苗对去势效果好，方便使用，稳定性好。

A chicken luteinizing hormone releasing hormone recombinant antigen castration vaccine and its preparation method

The invention provides a chicken luteinizing hormone releasing hormone in ovariectomized recombinant antigen vaccine and its preparation method, the method includes: (1) cLHRH (2) gene; gene sequence on Design of synthesis, annealing, enzyme digestion and ligation, and then transferred into E.coli cells. The recombinant plasmid (3; the preparation of the original bacteria); (4) induced by lactose; (5) low temperature osmotic shock isolation and purification; (6) using 10 * Aldehydated saline Aldehydated; (7) with seedling. The preparation method is simple, and the cost is low. In the whole process of preparation, it does not involve any substances that are potentially toxic, harmful or difficult to degrade to animals. The prepared vaccine has good castration effect, convenient use and good stability.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法
本专利技术属于去势疫苗
，具体涉及一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法。
技术介绍
促黄体素释放激素(Luteinizinghormorereleasinghormore，LHRH)是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(LH)及促卵泡激素(FSH)，这些激素能促进性腺及性器官的正常发育，维持动物的生殖功能。去势疫苗可免疫调控动物内分泌系统的性相关激素水平，抑制动物性器官发育，使动物丧失性行为和性功能，从而防止混乱交配(引起畜群退化)和争斗，促进动物生长，改善胴体组成和肉质，使肉质鲜嫩并防止膻味，提高饲料报酬。其机理是通过LHRH合成抗原或重组抗原作疫苗免疫动物后，在体内形成LHRH抗体，中和内源性LHRH，从而显著降低睾酮及雌激素等性激素水平，达到温和去势的目的。与传统手术去势相比，疫苗去势不仅简便易行，给管理者带来极大的方便，尤其适合于规模化养殖和放牧畜群，而且可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降，另外疫苗去势可适用于大动物或小动物、雌性或雄性动物、幼龄和成年动物、畜禽和其他动物，再者疫苗去势可通过配套技术实现可逆性控制。但现在并未见有效果较佳的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法，该制备方法简便，成本低，制得的疫苗去势效果较佳，使用方便。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗，其制备方法包括以下步骤：(1)设计cLHRH基因，序列如下：P1:5’-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGAACGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGAACTAATGAACTCGAGCA-3’(SEQIDNO:1)；P2:5’-TGCTCGAGTTCATTAGTTCGGGCGCAGACCGTAAGACCAATGTTCACCGCCACCCGGCTGCAGGCCGTAAGACCAGAGCTCACCGCCGTTCGGACGCAGACCGTAGGACCAGTGTTCAGCCATGGCC-3’(SEQIDNO:2)；(2)对设计的基因序列进行合成、退火、酶切、连接，然后再转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；(3)将重组质粒接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，获得原始菌液；(4)将原始菌液按接种量为2％-3％接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，待菌液OD600nm值为0.6-0.7时加入终浓度为20-30g/L的乳糖诱导培养5-6h；(5)将步骤(4)诱导培养后的菌液离心，弃上清，得第一沉淀，将第一沉淀置于2-8℃高渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，弃上清，得第二沉淀，将第二沉淀置于2-8℃低渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，收集上清液；(6)将步骤(5)所得上清液用0.22μm膜过滤除菌，然后加入除菌后所得液液1/10-1/5体积的10×醛化盐水，混匀，置于2-8℃，醛化处理72-76h，得醛化后的蛋白液；(7)将醛化后的蛋白液中加入吐温-80，混匀，得水相，其中吐温-80占水相总体积的4％；将注射用白油与司本-80按体积比为94:6比例，混匀，121℃灭菌60min，得油相；将油相与水相按2:1比例乳化，制成油包水乳剂，将油包水乳剂与1％吐温盐水按体积比为3:7比例乳化，制得鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗。进一步地，步骤(4)中乳糖添加量为20g/L。进一步地，步骤(4)中乳糖诱导时间为6h。进一步地，步骤(5)中高渗液通过以下方法制备得到：分别称取Tris484g、EDTA146g和蔗糖40kg，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用HCl调pH值至8.0，继续添加注射用水至200L，混匀后于121℃高压灭菌30min，制得。进一步地，步骤(5)中低渗液通过以下方法制备得到：分别称取Tris484g和EDTA146g，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用HCl调pH值至8.0，继续添加注射用水至200L，混匀后于121℃高压灭菌30min，制得。进一步地，步骤(6)中10×醛化盐水通过以下方法制备得到：将氯化钠溶解于注射用水中配成8.75％盐水，以121℃高压灭菌30分钟，冷却后，于每升盐水中加入5ml福尔马林，混合均匀，制得。进一步地，步骤(7)中1％吐温盐水通过以下方法制备得到：向每升注射用水中加入氯化钠9g，吐温-8010mL，混合均匀，121℃高压灭菌30分钟，制得。本专利技术提供的一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法，具有以下有益效果：(1)因为cLHRH重组抗原为可溶性蛋白质，并设计带有特定“信号肽”，可以采用“渗透休克”的特殊方法，选择性地诱导cLHRH融合抗原从细菌中分泌释放出来，继而经离心工艺固液分离，直接获取高纯度的cLHRH融合抗原。与常规重组大肠杆菌表达蛋白的分离提取工艺相比，该纯化工艺不仅简便，更避免了细菌裂解工艺给蛋白纯化带来的麻烦，更避免了细菌成分的污染。(2)在制备过程中由于采用了乳糖作为表达的诱导剂，又用蔗糖作为渗透休克分泌的诱导剂，本产品原液的整个生产过程不涉及任何对动物具有潜在的有毒、有害或难以降解的物质。(3)该制备方法简单，成本低，制备的疫苗对去势效果好，方便使用，稳定性好。附图说明图1为乳糖诱导后cLHRH目的蛋白纯度分析结果图。具体实施方式实施例1cLHRH-RA-RS1株重组表达质粒的构建1、cLHRH基因的设计和人工合成基因片段的设计根据鸡促黄体素释放激素(cLHRH)的氨基酸序列及相应的大肠杆菌偏爱密码子，并结合pET-32c质粒本身的特点设计两条互补cLHRH基因序列。在确保插入载体后阅读框架正确的前题下，在5‘端和3’端分别加上Ncol和Xhol两个酶切位点，酶切位点前加两个保护性碱基，用DNA自动合成仪合成基因，基因序列如下:P1:5’-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGAACGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGAACTAATGAACTCGAGCA-3’(SEQIDNO:1)P2:5’-TGCTCGAGTTCATTAGTTCGGGCGCAGACCGTAAGACCAATGTTCACCGCCACCCGGCTGCAGGCCGTAAGACCAGAGCTCACCGCCGTTCGGACGCAGACCGTAGGACCAGTGTTCAGCCATGGCC-3’(SEQIDNO:2)2、cLHRH基因片段的退火将人工合成的P1及P2基因片段分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl(相当于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超纯水中混匀，置沸水浴中2分钟后缓慢冷却至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计cLHRH基因，序列如下：P1:5’‑GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGAACGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGAACTAATGAACTCGAGCA‑3’；P2:5’‑TGCTCGAGTTCATTAGTTCGGGCGCAGACCGTAAGACCAATGTTCACCGCCACCCGGCTGCAGGCCGTAAGACCAGAGCTCACCGCCGTTCGGACGCAGACCGTAGGACCAGTGTTCAGCCATGGCC‑3’；(2)对设计的基因序列进行合成、退火、酶切、连接，然后再转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；(3)将重组质粒接种于含Amp的LB培养基中，于36‑37℃，160‑250r/min条件下培养，获得原始菌液；(4)将原始菌液按接种量为2％‑3％接种于含Amp的LB培养基中，于36‑37℃，160‑250r/min条件下培养，待菌液OD600nm值为0.6‑0.7时加入终浓度为20‑30g/L的乳糖诱导培养5‑6h；(5)将步骤(4)诱导培养后的菌液离心，弃上清，得第一沉淀，将第一沉淀置于2‑8℃高渗液中重悬，冰浴10‑15min，离心，弃上清，得第二沉淀，将第二沉淀置于2‑8℃低渗液中重悬，冰浴10‑15min，离心，收集上清液；(6)将步骤(5)所得上清液用0.22μm膜过滤除菌，然后加入除菌后所得液液1/10‑1/5体积的10×醛化盐水，混匀，置于2‑8℃，醛化处理72‑76h，得醛化后的蛋白液；(7)将醛化后的蛋白液中加入吐温‑80，混匀，得水相，其中吐温‑80占水相总体积的4％；将注射用白油与司本‑80按体积比为94:6比例，混匀，121℃灭菌60min，得油相；将油相与水相按体积比为2:1比例乳化，制成油包水乳剂，将油包水乳剂与1％吐温盐水按体积比为3:7比例乳化，制得鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗。...

【技术特征摘要】
1.一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计cLHRH基因，序列如下：P1:5’-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGAACGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGAACTAATGAACTCGAGCA-3’；P2:5’-TGCTCGAGTTCATTAGTTCGGGCGCAGACCGTAAGACCAATGTTCACCGCCACCCGGCTGCAGGCCGTAAGACCAGAGCTCACCGCCGTTCGGACGCAGACCGTAGGACCAGTGTTCAGCCATGGCC-3’；(2)对设计的基因序列进行合成、退火、酶切、连接，然后再转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；(3)将重组质粒接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，获得原始菌液；(4)将原始菌液按接种量为2％-3％接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，待菌液OD600nm值为0.6-0.7时加入终浓度为20-30g/L的乳糖诱导培养5-6h；(5)将步骤(4)诱导培养后的菌液离心，弃上清，得第一沉淀，将第一沉淀置于2-8℃高渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，弃上清，得第二沉淀，将第二沉淀置于2-8℃低渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，收集上清液；(6)将步骤(5)所得上清液用0.22μm膜过滤除菌，然后加入除菌后所得液液1/10-1/5体积的10×醛化盐水，混匀，置于2-8℃，醛化处理72-76h，得醛化后的蛋白液；(7)将醛化后的蛋白液中加入吐温-80，混匀，得水相，其中吐温-80占水相总体积的4％；将注射用白油与司本-80按体积比为9...

【专利技术属性】
技术研发人员：何信群，龚文波，吉传义，谢建勇，杨建波，李峰，伏刚，方鹏飞，严成，郝伟伟，潘华柱，扶海，
申请(专利权)人：华派生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51