一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物、探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物、探针及其试剂盒。引物序列如SEQ ID NO.1～4所示，探针序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，探针的5

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物、探针及其试剂盒


[0001]本专利技术属于兔病毒性出血症检测
，具体涉及一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物、探针及其试剂盒。

技术介绍

[0002]兔病毒性出血症是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)引起的一种急性、高致死性、高度接触性传染病，俗称兔瘟。兔病毒性出血症病毒属于杯状病毒科兔病毒属，兔病毒属的成员还包括非致病性兔杯状病毒(RCV)、欧洲褐色野兔综合征病毒(EBHSV)，RHDV、RCV、EBHSV具有相同的遗传特性，但亲缘关系较远。2010年以前分离的兔病毒性出血症病毒分为G1
‑
G6六个基因型，为通常所说的经典兔瘟病毒，其中G6为抗原变异株(也称RHDVa)。2010年首次在法国发现一种遗传特性、抗原性有别于经典兔病毒性出血症病毒的新毒株RHDV2(又称RHDVb)，并在欧洲、大洋洲、美洲扩散。
[0003]RHDV2与经典兔病毒性出血症病毒感染致死家兔具有类似的典型症状，但经典兔病毒性出血症病毒仅对2月龄以上家兔易感，而RHDV2对15日龄以上家兔、野兔均易感，且用经典兔病毒性出血症病毒制备的疫苗并不能避免易感兔感染RHDV2。2020年4月我国在四川金堂某兔场首次发现RHDV2感染，致死率高达73.3％。该病毒对我国养兔业和生态环境安全造成了极大的威胁。
[0004]兔出血症(Rabbit haemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种急性、高传染性、高致病性疾病。经典的RHDV(也称RHDV1)只感染家兔，且易感染2月龄以上的家兔，染病后家兔的病死率达90％，常于感染后48～72h死亡，死亡家兔具有呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器水肿、淤血出血为特征，在全球许多国家和地区均有报道，呈爆发性流行，发病率和死亡率可高达90％，给养兔业造成极大经济损失。该病于1984年首先在中国被报道，随后迅速在全球大部分地区流行，同时RHDV1也发生了遗传变异。从系统发育关系上看，RHDV1可以分为G1～G6这6个基因型(GI.1)，中国的流行毒株主要为G2、G6型。2010年，在法国首次发现了RHDV的新毒株，研究者将其命名为RHDV2。2020年4月，在国内首次发现RHDV2型毒株。RHDV2与RHDV1毒株G1～G6型感染家兔致死的典型症状相似，但在遗传特性及抗原性上有很大差异，RHDV1易感染2月龄以上的家兔，未断奶仔兔不易感，RHDV2会感染不同日龄的家兔，未断奶仔兔最易感。同时由于RHDV1和RHDV2抗原之间的变异较大，导致它们无交叉保护性，这意味着使用经典兔瘟疫苗免疫接种后的各种日龄家兔均无抵抗RHDV2攻击的有效保护力。因此对发病家兔进行兔瘟诊断时，区分感染的是RHDV1还是RHDV2对疾病的预防控制具有十分重大的意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物、探针及其试剂盒，本专利技术分别针对RHDV1型和RHDV2型的VP60基因分别设计两个引物探针组，同时两组探针分别采用不同的荧光基团，因此用于RHDV1和RHDV2的单独检测，同时还可以
VP60基因特征性序列，根据两者的特征性序列设计相应的引物和探针，由于引物探针组均针对不同病毒基因的特征性基因序列设计而成，因此具有良好的特异性，不会出现交叉反应现象。此外为了实现对同一样品同时进行两种病毒的检测，两组探针分别采用不同的荧光基团，具体序列如下：
[0028]1、RHDV1检测用引物和探针设计
[0029]根据RHDV1 VP60基因设计检测用引物和探针，引物序列为：
[0030]RHDV1
‑
F：CCACAGAACAACCCATTCACA(SEQ ID NO.1)
[0031]RHDV1
‑
R：GTATCACAGCCGCGACCA(SEQ ID NO.2)
[0032]检测用探针序列为：
[0033]Probe RHDV1：HEX
‑
CCGCTTCATAGTTGCTGGATCAGG
‑
BHQ1(SEQ ID NO.5)
[0034]2、RHDV2检测用引物及探针设计
[0035]根据RHDV2 VP60基因设计检测用引物和探针，检测引物序列为：
[0036]RHDV2
‑
F：CGGTGACARTTGGACTTTCACTC(SEQ ID NO.3)
[0037]RHDV2
‑
R：CCGCATAGAAGTATCCATCAACAC(SEQ ID NO.4)
[0038]RHDV2实时荧光定量PCR检测用探针序列为：
[0039]Probe RHDV2：FAM
‑
ACTTYGCTTCCGGCTTCATGGAAC
‑
BHQ1(SEQ ID NO.6)
[0040]实施例2标准品的制备
[0041]1、RHDV1阳性标准品的制备
[0042](1)目的基因的扩增
[0043]使用病毒全基因组RNA/DNA提取RHDV1的总RNA，使用反转录试剂盒进行反转，利用RHDV1
‑
F/RHDV1
‑
R引物进行PCR以扩增得到RHDV1 VP60部分基因。PCR反应体系(25μL)：2
×
PCR Mix 12.5μL，反转录产物5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，ddH2O 5.5μL。
[0044]PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增产物目的片段大小应为127bp。扩增序列如下：
[0045]CCACAGAACAACCCATTCACAGCCGTGCTGAGCCAGATGTACGCTGGCTGGGCTGGTGGCATGCAGTTCCGCTTCATAGTTGCTGGATCAGGTGTGTTTGGTGGGCGACTGGTCGCGGCTGTGATAC
[0046](2)目的基因重组质粒的构建及鉴定
[0047]PCR产物经电泳和胶回收纯化后，连接至PGM
‑
T载体种，并转化至DH5α感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落进行单克隆培养，提取质粒进行PCR和测序鉴定。鉴定为阳性的重组质粒，使用微量分光光度计测定质粒浓度，并根据公式计算每微升质粒的拷贝数，稀释至104拷贝/μL作为RHDV1的阳性标准品。
[0048]2、RHDV2阳性标准品的制备
[0049](1)目的基因的扩增
[0050]使用病毒全基因组RNA/DNA提取RHDV1的总RNA，使用反转录试剂盒进行反转，利用RHDV2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1～4所示。2.一种同时检测RHDV1和RHDV2的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5
’
端标记有荧光基团，3
’
端标记有猝灭基团。4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光基团为HEX或FAM；猝灭基团为BHQ1。5.一种同时检测RHDV1和RHDV2的核酸组合物，其特征在于，包括权利要求1所述引物，以及权利要求2～4任一项所述探针。6.一种同时检测RHDV1和RHDV2的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物，以及权利要求2～4任一项所述的探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜德燕，邱文英，罗颖，易洁，申建青，李金海，
申请(专利权)人：华派生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：