一种酶促合成山奈酚的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶促合成山奈酚的方法，其中涉及两种融合蛋白TrxA‑His‑F3H、TrxA‑His‑FLS1的制备及酶活性检测，并设计缓冲液体系，反应缓冲液为0.1M Tris‑HCl（pH7.2），100μL反应体系中含有0.4%抗坏血酸、10%甘油、8.2 mMα‑酮戊二酸、0.01 mM硫酸亚铁、0.5 mM柚皮素、3.3μg TrxA‑His‑F3H、1.8μg TrxA‑His‑FLS1；并通过优化反应体系pH值、反应时间和温度，在体外建立一步高效合成山奈酚的方法。CCK‑8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。

A method of enzymatic synthesis of kaempferol

The invention discloses a method for enzymatic synthesis of kaempferol, which involves two kinds of fusion protein TrxA His F3H, TrxA His FLS1 preparation and detection of enzyme activity, and the design of buffer system, reaction buffer for 0.1M Tris HCl (pH7.2), 100 L reaction system contains 0.4% ascorbic acid, 10% glycerol, 8.2 mM alpha ketoglutaric acid, ferrous sulfate 0.5 mM, 0.01 mM naringenin, 3.3 g TrxA His F3H, 1.8 g TrxA His FLS1; and by optimizing the reaction pH value, reaction time and temperature, a method of establishing step for efficient synthesis of kaempferol in vitro. Detection of inhibitory effect of kaempferol synthesis on the growth of tumor cells CCK 8 method.

【技术实现步骤摘要】
一种酶促合成山奈酚的方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种酶促合成山奈酚的方法。
技术介绍
山奈酚是一种广泛存在于水果、蔬菜和中草药中的次生代谢产物——黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种生物学功能，且安全无毒，在食品和医药领域具有良好的应用前景(张雅雯等.山奈酚生物功能研究进展.生命科学,2017；29(4):400-5)。目前，山奈酚的常用制备方法是有机溶剂提取法，然而该方法步骤繁琐复杂、周期长、得率低、成本高，需要用到大量的有机溶剂，而且原材料的来源易受到季节的限制，因而不利于工业化生产。获得山奈酚的另外一种方法是化学合成法。该方法不仅合成步骤繁琐复杂、反应条件苛刻、反应催化剂多为有毒物品、产率低，且区域选择性差、易产生大量的副产物，因而增加了分离纯化的难度和生产成本，极大地限制了山奈酚的工业化生产。近年来，随着对黄酮类化合物生物合成途径的逐步阐明，学者们开始尝试用生物转化法在微生物体内合成黄酮类化合物，并取得了成功。如SaileshMalla等(MallaS,etal.Regiospecificmodificationsofnaringeninforastragalinproductioninescherichiacoli.Biotechnologyandbioengineering,2013,110:2525-2535)将拟南芥的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因和黄烷酮合酶(FLS)基因以及大豆的类黄酮-3-O-糖基转移酶(UGT78K1)基因转入大肠杆菌BL21，利用大肠杆菌的内源性葡萄糖途径合成的UDPG作为糖基供体，将柚皮素进行特异性修饰，最终了合成紫云英苷。然而，采用微生物发酵法生产黄酮类化合物仍然存在很多缺点。首先，合成途径中涉及到的关键酶以及合成过程中产生的中间产物会抑制宿主菌的生长。其次，在菌体生长前期涉及到多个基因的表达，而且基因之间的协同表达缺乏一种理性的调控方式，给宿主菌带来较大的代谢负担。最后，为了提高产量，敲除大肠杆菌体内的某些代谢途径同样会影响菌体的生长。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题：克服目前山奈酚生产方法的局限性，提供一种酶促合成山奈酚的方法，是一种在生物酶的作用下高效合成山奈酚的新方法。本专利技术所采用的技术方案如下：1.山奈酚生物合成途经中关键酶的克隆、表达和纯化从拟南芥中克隆黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因f3h和黄烷酮合酶(FLS)基因fls1至原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h和pET-32a-fls1，按常规方法诱导表达和纯化融合蛋白。具体包括：一种融合蛋白TrxA-His-F3H，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：(1)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列SEQIDNo.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或(3)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。所述的融合蛋白TrxA-His-F3H的制备方法，包括以下步骤：(1)黄烷酮-3-羟化酶(F3H)基因f3h的克隆：f3h基因的PCR扩增，连接到载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h；(2)将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白。进一步地，步骤(1)中f3h基因的PCR扩增，设计两对引物分别为：正向引物为斜体碱基示酶切位点BamHI；反向引物为斜体碱基示酶切位点EcoRI。一种融合蛋白TrxA-His-FLS1，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：(1)由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列SEQIDNo.2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或(3)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。上述融合蛋白TrxA-His-FLS1的制备方法，包括以下步骤：(1)黄烷酮合酶(FLS)基因fls1的克隆：fls1基因的PCR扩增，连接到载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-fls1；(2)将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白。进一步地，步骤(1)中fls1基因的PCR扩增，设计两对引物分别为：正向引物为斜体碱基示酶切位点BamHI；反向引物为斜体碱基示酶切位点EcoRI。2.融合蛋白TrxA-His-F3H和TrxA-His-FLS1的酶活性检测2.1融合蛋白TrxA-His-F3H的黄烷酮3-羟化酶活性检测：参照文献中的反应体系，用聚酰胺薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱质谱法(HPLC/MS)检测融合蛋白TrxA-His-F3H将柚皮素(NRN)转化为二氢山奈酚(DHK)的催化能力。2.2融合蛋白TrxA-His-FLS1的黄酮醇合酶活性检测：参照文献中的反应体系，用聚酰胺TLC法和HPLC/MS法检测融合蛋白TrxA-His-FLS1将DHK转化为山奈酚(KMF)的催化能力。3.一步法合成体系的建立设计缓冲液体系，反应缓冲液为0.1MTris-HCl(pH7.2)，100μL反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mMα-酮戊二酸、0.01mM硫酸亚铁、0.5mM柚皮素、3.3μgTrxA-His-F3H、1.8μgTrxA-His-FLS1；并通过优化反应体系pH值、反应时间和温度，在体外建立一步高效合成山奈酚的方法，上述反应体系在恒温摇床反应40min、温度40℃、转速250rpm。4.CCK-8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。专利技术效果1、本专利技术开发了一种制备融合蛋白TrxA-His-F3H的方法，该方法具有设备简单、易操作、效率高、成本低、周期短等特点，制备的融合蛋白具有黄烷酮3-羟化酶活性，其纯度超过95％。2、本专利技术开发了一种制备融合蛋白TrxA-His-FLS1的方法，该方法具有设备简单、易操作、效率高、成本低、周期短等特点，制备的融合蛋白具有黄烷酮合酶活性，其纯度超过95％。3、本专利技术开发了一种在体外高效酶促合成山奈酚的新方法，最终产量为31.94±1.14mg/L，合成的山奈酚对肿瘤细胞MCF-7的生长具有明显的抑制作用，其IC50为63.25μM。附图说明图1SDS-PAGE电泳分析纯化的融合蛋白。M，蛋白质分子量标准品；1，融合蛋白TrxA-His-F3H；2，融合蛋白TrxA-His-FLS1。图2分析融合蛋白TrxA-His-F3H和TrxA-His-FLS1的酶活性及一步合成山奈酚的结果图。A，聚酰胺TLC法分析融合蛋白TrxA-His-F3H的黄烷酮3-羟化酶活性。1，反应产物。B，聚酰胺TLC法分析融合蛋白TrxA-His-FLS1的黄酮醇合酶活性。1，反应产物。C，聚酰胺TLC法分析从山奈酚的一步合成。1，反应产物。D，HPLC法分析融合蛋白TrxA-His-F3H和TrxA-His-FLS1的酶活性及山奈酚的一步合成。图3NRN、DHK和KMF的质谱分析结果图。图4CCK-8法测定合成的山奈酚对肿瘤细胞生长抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白TrxA‑His‑F3H，其特征在于，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或(3)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白TrxA-His-F3H，其特征在于，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：(1)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列SEQIDNo.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或(3)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。2.权利要求1所述的融合蛋白TrxA-His-F3H的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因f3h的克隆：f3h基因的PCR扩增，连接到载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h；(2)将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白。3.根据权利要求2所述的融合蛋白TrxA-His-F3H的制备方法，其特征在于，步骤(1)中f3h基因的PCR扩增，设计两对引物分别为：正向引物为5’-AAGGATCCATGACTCGTCTCGCTCGTGA-3’，斜体碱基示酶切位点BamHI；反向引物为5’-AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA-3’，斜体碱基示酶切位点EcoRI。4.一种融合蛋白TrxA-His-FLS1，其特征在于，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：(1)由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列SEQIDNo.2限定的氨基酸序列同...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新跃，张智萍，何妍之，黄岳，陈磊，丁笠，刘雅娴，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32