2-氨基酚1，6-双加氧酶、其基因及用途制造技术

一种新２－氨基酚１，６－双加氧酶，其氨基酸组成具有如序列表２　　ＮＯ．２所示的３１４个氨基酸序列为β－亚基和如序列表１　　ＮＯ．２所示的２７１个氨基酸序列为α－亚基，酶是由两个β－亚基和两个α－亚基组成。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物生物技术和基因工程
，具体地说，它涉及一个来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCCNo.1028菌株的基因，该基因大小为1770 bp碱基对，其表达一个具有活性的酶，该酶可以催化2-氨基酚进行1，6位开环裂解，也可以催化对硝基氯代苯直接开环裂解。因此，该基因可以用于构建基因工程菌，生产具有活性的酶，用于含对硝基氯代苯类化合物的污水处理以及用于生物转化加工工程。
技术介绍
氯代硝基苯类化合物(Chloronitrobenzenes，CNBs)作为重要的化工中间体被广泛用于生产和制造橡胶、染料、农药、医用药品等，以对氯硝基苯为例，我国2000年产量为12万吨。氯代硝基苯等芳香族化合物具有多种途径进入环境成为污染物，例如残留在生产过程中排放的废水，或者由环境中含芳香环化合物的不彻底降解和转化而来，例如硝基苯胺和氯代硝基苯胺是农药、染料、颜料等不彻底分解产生的；我国自来水供应多采用氯化消毒，氯代硝基苯是检测到的氯化消毒副产物之一。欧共体早已宣布氯代硝基苯是一种特别有害的化合物且在环境中难以降解，其危害包括引起人和动物的高铁血红蛋白血症(Methemoglobinemia)，并且是一种诱变剂和致癌剂，五氯硝基苯破坏肺、肝、肾的功能，并直接损害神经系统。因此，研究氯代硝基苯类化合物的生物降解和酶促降解对于保护环境及提高人类健康具有重要意义。目前，国内外就氯代苯类或者硝基苯类有机物的生物降解进行了大量研究，而对芳环上同时存在氯原子和硝基的氯代硝基苯类化合物的研究报道则较少，其主要原因是当氯原子和硝基同时存在时，由于二者的吸电子特性，导致芳环裂解更加困难。许多能够降解氯代苯或硝基苯等芳烃衍生物的菌种并不能降解对氯硝基苯。迄今，除了国外个别报道之外，单一菌种或混合菌种对氯硝基苯的降解能力、降解性质等所知甚少。而对于氯代硝基苯类的酶促降解和转化的研究则更少。此外，利用酶促反应的生物加工和转化更是近年来新兴的生物工程技术，可以在常温常压条件下以非常经济、高效的方法转化加工获得高纯度的高品质产品，目前已经在生物制药领域、生物化工领域得到应用，如手性药物的生产和丙烯酰胺的生产，但在氯代硝基苯类化合物的生物转化方面尚未见到报道。因此，研究氯代硝基苯生物降解途径、开发酶制剂资源有着重要的意义。
技术实现思路
针对上述存在问题，本专利技术的目的是为氯代硝基苯类及其相关衍生化合物的酶促降解和转化提供一种新的酶的基因及其由该基因编码的两个不同的蛋白产物β-亚基和α-亚基组成的2-氨基酚1，6-双加氧酶，该酶可以催化2-氨基酚进行1，6位开环裂解，也可以催化对硝基氯代苯开环裂解。因此，本专利技术提供的基因可以用于构建基因工程菌，生产具有活性的酶，用于含对硝基氯代苯类化合物的污水处理以及用于生物转化加工工程。2-氨基酚1，6-双加氧酶基因大小为1770bp碱基对，含有两个同方向的ORF开放阅读框架，两个开放阅读框架分别为如序列表2NO.1所示的942bp核苷酸序列和如序列表1NO.1所示的813bp核苷酸序列，其编码两个不同的蛋白产物，如序列表2NO.2所示的314个氨基酸序列为β-亚基和如序列表1NO.2所示的271个氨基酸序列为α-亚基。两个β-亚基和两个α-亚基组成一个具有活性的酶分子。该酶可以催化2-氨基酚进行1，6位开环裂解，也可以催化对硝基氯代苯直接开环裂解。2-氨基酚1，6-双加氧酶基因来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株。将该菌在LB平板上的单菌落挑到LB培养液中，30℃振荡培养，收集菌体，提总DNA，用Mbo I部分酶切至30kb左右的片断。用SuperCos 1作为载体(购自Stratagene Company，USA)，载体先用Xba I酶切后，去磷酸化，再用BamH I酶切成6.8kb和1.1kb的两个片段。将基因组部分酶切的片段和处理后的载体在16℃用T4 DNA连接酶连接。连接好的片段用Gigapack III XL包装蛋白(购自StratageneCompany，USA)包装。最终转染至大肠杆菌XL 1-blue MR(购自StratageneCompany，USA)中，建立Cosmid基因文库。从基因文库中筛选到有2-氨基酚1，6-双加氧酶活性的3个阳性克隆。将其中一个克隆的质粒提取出来测序。从序列中分析出编码2-氨基酚1，6-双加氧酶α、β亚基的基因，这两个亚基的基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列分别如序列表1和序列表2所示。以这两个亚基的氨基酸序列在NCBI上进行blastx比对，发现α-亚基氨基酸序列与2-aminophenol-1，6-dioxygenase alpha subunit(登录号为AAB71525)的序列相似性为56％；β-亚基的氨基酸序列与2-aminophenol 1，6-dioxygenase betasubunit(登录号为AAK26519)的序列相似性为79％。同时，从睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1(CGMCC No.1028)细胞中纯化出2-氨基酚1，6-双加氧酶蛋白，并将酶蛋白的α、β-亚基送到北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室，对两个亚基的N端各8个氨基酸进行测序，测序结果为α亚基，TVVSAFLV；β亚基，MQGEIIAG。与得到的基因序列所编码的N端氨基酸序列完全相同。由此可以肯定，得到的序列所编码的蛋白具有2-氨基酚1，6-双加氧酶的活性。含本专利技术提供的基因的转化子构建和酶的表达将本专利技术提供的基因连接到载体SuperCos 1后，以Gigapack III XL包装蛋白包装，或也可以将该基因连接到其他表达载体，然后将包装好的载体或连接载体转化到感受态大肠杆菌或其他细菌，经LB培养基或其他培养基培养，含有连接基因片段的菌落就为转化子，以SuperCos 1为载体的转化子不需要诱导就可以表达酶活性，而以其他的表达载体为载体的转化子则需要载体相应的诱导物诱导表达酶活性。以这些转化子可以用于酶的生产或这些转化子可以直接用于含对硝基氯代苯或邻氨基酚废水处理或这些底物的生物转化工程。本专利技术提供的基因所编码的酶对硝基氯代苯开环酶活性的测定方法为对硝基氯代苯在280nm处有最大吸收峰，紫外分光光度计测定单位时间内280nm处的光吸收值的减少量，可测得对硝基氯代苯开环酶的酶比活。反应体系包括0.3μmol对硝基氯代苯，50mmol/L磷酸盐缓冲液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的纯蛋白溶液，酶促反应总体积为3mL。本专利技术提供的基因所编码的酶2-氨基酚1，6-双加氧酶活性的测定方法为2-氨基苯酚的反应产物2-氨基粘康酸半醛在380nm处有最大吸收峰，紫外分光光度计测定单位时间内380nm处的光吸收值的增加量，可测得双加氧酶的酶比活。反应体系包括0.3μmol 2-氨基苯酚，50mmol/L磷酸盐缓冲液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的纯蛋白溶液，酶促反应总体积为3mL。2-氨基粘康酸半醛的摩尔消光系数ε＝15.1 L mmol-1cm-1。1个单位的酶活力定义为1mg蛋白每分钟生成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘双江，吴建峰，刘志培，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：