本发明专利技术提供了一种丹酚酸酶，能水解丹酚酸Ｂ，使之变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽。本发明专利技术还提供了丹酚酸酶转化丹酚酸Ｂ的方法。本发明专利技术也提供了一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽。本发明专利技术还提供了一种处理丹参和三七混合药材或提取物的方法，该方法能使丹参中的丹酚酸Ｂ转化为丹参素、咖啡酸和其和二聚体，使三七皂苷转化为活性更高的Ｒｇ３、Ｃ－Ｋ、Ｒｇ２、Ｒｈ２、Ｒｈ１次生皂苷和苷元。其酶转化提取成分，活性高，可用于医药、功能食品和功能化妆品。
【技术实现步骤摘要】
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技术介绍
:(1)丹参素(danshensu)的结构式(2)咖啡酸结构式:(3)丹参酸丙结构式.-(4)迷迭香酸结构式:5Tanshmone lla Cryptotanshinone Tanshinone I三七又称ffl七，是五加科人参属植物，学名为尸a朋moto^'/7se/^ (Burk. ) F.H.Chen。 三七根部为我国名贵的中药材，具有活血化瘀、消肿止痛、滋补强壮等功效，是治疗跌打 损伤的良药。三七人参皂苷为主要有效成分之一，含量较高的主要皂苷为人参皂苷为Rbl、 Rgl和Rl，中国药典2005年版上规定三七药材Rbl、 Rgl和Rl皂苷含量5%以上，还含0. 2% 左右的的Re和Rd。其三七人参皂苷结构和酶转化的次生皂苷结构为-<table>table see original document page 6</column></row><table>20(S)-PPT Ginsenoside 20</ )-PPT GinsenosideGinsenosideRlR2ReRha'-2Glc-Glc- (5)RlXyl1-2GlcGlc-(5)RglGlc-Glc- (5)Rg2Rha'-2Glc-H-RhlGlc-H-、』表2原人参」醇人参培昔(Protopanaxatriol type ginsenosides， PPT)如上所述丹参药材的主要成分是丹酚酸B和丹参酮，三七的主要皂苷Rbl、 Rgl和Rl、 Re和Rd。目前丹参和三七提取物主要用于制备复方丹参片和复方丹参滴丸；其提取方法是 用乙醇提取丹参酮等丹参脂溶性物质、再用水提取水溶性物质，与三七粉或者三七水提取 或醇类提取混合，制备复方丹参片；还有丹参和三七混合水煎提取水溶性成分，用于制备 复方丹参滴丸(中华人民共和国药典，2005年版，化学工业出版社，p527-528);也就是 说乃参和三七有效成分提取是水或者醇提取法(王雪莉等，新技术在中药制剂研究中的应 用，中草药，2001年，32巻第二期，176-178);由此丹参和三七提取物中的主要有效成 分基本上没有变化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能水解丹酚酸B，使之变成活性更好的丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物的丹酚酸酶。本专利技术的目的还在于提供一种用所述的丹酚酸酶转化乃酚酸B的方法。 本专利技术的目的也在于提供一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，它能使丹参中的丹酚酸B转化为丹参素和二聚体、使三七皂苷转化为活性更高的Rg3、 C-K、 Rg2、 Rh2、 Rhl次生皂苷和苷元。本专利技术的目的还在于提供一种用所述的丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶处理丹参和三七混合药材的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的一种丹酚酸酶，能水解丹酚酸B，使之变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，来源于 微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得用在液态或者固态用丹酚酸B诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲液 浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者 将丹参植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者 将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液； 其中任选地包括将酶液浓缩，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓縮液。 所述的丹酚酸酶的制备方法还可以进一步包括浓縮的步骤，其中所述的浓縮是采取加 入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓 冲液的浓度为0. 001-0. 5 M， pH为3-10。所述的丹酚酸酶转化丹酚酸B的方法，包括使丹酚酸酶与丹酚酸B单体和/或含有丹酚 酸B的药材和/或其提取物中丹酚酸B反应的步骤，反应温度20-7(TC，反应时间为10-40 小时。一种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌， 丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得在液态或者固态用丹酚酸B和三七人参皂苷诱导培养所述的微生物，其中固态培养 之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者 将丹参和三七植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者 将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；其中任选地包括将酶液浓縮，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓縮液。 所述的酶的制备方法还可以进一步包括浓縮的步骤，其中所述的浓缩是采取加入硫酸 铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓冲液的 浓度为0. 001-0. 5 M， pH为3-10。一种处理丹参和三七混合药材或提取物的方法，该方法能使丹参中的丹酚酸B转化为 丹参素、咖啡酸和其和二聚体，使三七皂苷转化为活性更高的Rg3、 C-K、 Rg2、 Rh2、 Rhl 次生皂苷和苷元，方法如下使丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶和丹参、三七混合药材反应，反应温度20-70°C，反应时间为10-50小时；或者将曲霉菌、细菌或酵母菌直接接种到丹参或丹参和三七的混合药材中，发酵培养3-8天；或者使丹参和三七的混合药材自身的酶发挥丹酚酸酶或三七人参皂苷酶作用，包括以下 步骤丹参和三七生药材或者干药材加2-20倍水、混合，泡开药材，迅速加热至100 。C并保持2-5分钟，然后迅速冷却至5(TC，保持原酶活的60%以上，在50-9(TC并保持 酶反应0. 5-2小时；在100-120'C灭酶1-2小时。丹酚酸酶和三七皂苷酶的混合酶处理丹参和三七混合药材，使其丹酚酸B和三七皂苷 转化成活性更高的丹参素、丹参素咖啡酸二具体，Rg3、 C-K、 Rg2、 Rh2、 Rhl次生皂苷；还 可以进一步制备其水溶性成分和脂溶性成分。水溶性成分和脂溶成分经硅胶柱、C18硅胶柱、 分子筛分离方法得到丹参素、咖啡酸和其二聚体、丹参酮和三七皂苷酶转化的单体。上述 酶转化提取成分，活性更高，可用于医药、功能食品和功能化妆品。定义丹酚酸酶本专利技术所述的丹酚酸酶是指水解丹酚酸B，变成丹参素、咖啡酸和其二聚体 化合物的酶。丹酚酸酶活力单位的定义:精确称取lg丹参原生药粗粉，加入5毫升0. 02摩尔、pH5. 0 醋酸缓冲液，再加入3毫升酶液，于40'C下进行反应10-20小时，煎煮灭酶，溶液过滤定 容到18毫升，做薄层层稀(TLC)，硅胶版为Silica Gel 60 F254,点样量IO叱，展开剂 为乙酸乙脂甲酸=7: 1 (V: V)，展开后用三氯化铁溶液显色，再用工具Bandscan测定丹 参素斑点，与丹参素标准品斑点比较计算产物丹参素的产率。上述条件下每小时生成0.1 摩尔丹参素所用的丹酚酸酶量为一个酶活力单位。本专利技术所述的三七人参皂苷酶，包括三七二醇皂苷酶和三七三醇皂苷酶三七二醇皂 苷酶是指水解三七二醇皂苷Rbl、 Rd的糖基，变成Rg3、 Rh2、 C-K和其苷元的酶；三七三 醇皂苷酶是指水解三七三醇皂苷Re、 Rl、 Rgl的糖基，变成Rg2、 Rhl和其苷元的酶三七的二醇皂苷酶活力单位的定义酶反应底物为20毫摩尔、pHO. 5的醋酸缓冲液(含 20%乙醇)的0.02摩尔的三七(人参)皂苷Rbl。 0.5毫升的Rbl和0.5毫升的酶混合，在 4CTC反应10-20小本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种丹酚酸酶，能水解丹酚酸Ｂ，使之变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得： 用在液态或者固态用丹酚酸Ｂ诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲液浸出、离心除渣得 酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者 将丹参植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者 将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液； 其中任选地包括将酶液浓缩，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓缩液。
【技术特征摘要】
1.一种丹酚酸酶，能水解丹酚酸B，使之变成丹参素、咖啡酸和其二聚体化合物，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得用在液态或者固态用丹酚酸B诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者将丹参植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；其中任选地包括将酶液浓缩，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓缩液。2. 如权利要求1的酶，其制备方法还进一步包括浓縮的步骤，其中所述的浓缩是采取加入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓冲液的浓度为0. 001-0. 5 M， pH为3-10。3. 如权利要求1或2的酶，其制备方法中所述的液态培养是加入诱导物丹酚酸酸B、或0. 1%-3%的丹参粉、或相当于0. 1%-3%丹参干物的丹参提取物，发酵培养2-8天；固态培养时加入培养基1%-30%的丹酚酸酸B和/或丹参粉和/或丹参提取物，培养2-8天。4. 如权利要求3的酶，其中所述的曲霉菌是黑曲霉菌力邵er^72s m>er。5. 如权利要求3的酶，其中所述的曲霉菌是米曲霉菌力印er^7^As ory幼e。6. 如权利要求1或2的酶，其中所述的谷物芽是麦芽、玉米芽或高粱芽，在谷物发芽中过程中使之接触丹酚酸B或含有丹酚酸B的药材或药材提取物，发芽温度12-25C，发芽时间是3-6天。7. 权利要求1 6的丹酚酸酶转化丹酚酸B的方法，包括使丹酚酸酶与丹酚酸B单体和/或含有丹酚酸B的药材和/或其提取物中丹酚酸B反应的步骤，反应温度20-7(TC，反应时间为10-40小时。8. —种丹酚酸酶和三七人参皂苷酶的混合酶，来源于微生物包括曲霉菌、细菌或酵母菌，丹参植物或谷物芽，通过下述方法制得在液态或者固态用丹酚酸B和三七人参皂苷诱导培养所述的微生物，其中固态培养之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者将丹参和三七植物破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者将谷物芽破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；其中任选地包括将酶液浓縮，再用缓冲液溶解，除渣得所述的丹酚酸酶浓縮液。9. 如权利要求8的酶，其制备方法还进一步包括浓縮的步骤，其中所述的浓縮是采取加入硫酸铵或者乙醇沉淀酶蛋白的方法，其中所述的缓冲液为醋酸、磷酸、Tris或NaCl，缓冲液的浓度为0. 001-0. 5 M， pH为3-10。10. 如权利要求8或9的酶，其制备方法中所述的液态培养是加入诱导...
【专利技术属性】
技术研发人员：金凤燮，鱼红闪，闫希军，朱永宏，周水平，张春枝，
申请(专利权)人：天津天士力制药股份有限公司，金凤燮，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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