一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法技术

一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，属于天然食品和药物提取技术领域。包括缓冲液萃取、硫酸铵盐析、柱层析等步骤，本发明专利技术提取率可达到约10mg/100g（纯酶/原料），纯度可达95%以上，提取所得的酶的最大反应速度约为3.5×105(U/min?g酶)，解决了莲蓬副产物的利用问题，能提高莲产物的经济附加值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于天然食品和药物提取
，特别涉及一种多酚氧化酶的提取方法。
技术介绍
多酹氧化酶(polyphenoloxidase, PP0)是一种广泛分布于真菌、植物、昆虫以及哺乳动物的金属蛋白酶。多酚氧化酶可分为三大类单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase)、双酹氧化酶(儿茶酹氧化酶catechol oxidse)和漆酶(laccase)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪 氨酸酶。在食品加工和果蔬生产中，多酚氧化酶是植物体氧化褐变的主要原因之一，对食品的变质有很大的损害作用。然而，从植物生理学角度考虑，多酚氧化酶在植物自防御系统里发挥重要作用，是其防御虫害、菌害的关键因素。多酚氧化酶是酚类代谢系统的关键性酶，能催化酚类转化成醌类，醌类与木质素构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，另外也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。目前，多酚氧化酶在黄瓜对黑星病的抗性，苹果对轮纹病的抗性，香蕉对束顶病的抗性，柠檬对流胶病的抗性，甘薯对蔓割病的抗性，水稻对白叶枯病的抗性的研究中取得了较大的进展。这方面的发展无疑促进了多酚氧化酶取代部分农药的发展，对环境保护和资源利用具有深远意义。另外，在茶叶的加工过程中，多酚氧化酶发挥的作用尤为突出，除了少量的绿茶、黄茶以外，大部分的茶叶发酵加工都是基于多酚氧化酶的催化氧化作用。研究发现利用外源的多酚氧化酶对发酵过程中的茶叶进行处理，可以改善茶叶的风味和口感，明显提高成茶的TF含量，减少TB含量。除此之外，多酚氧化酶在含酚废水的处理、环境中酚类毒物的降解、饮料加工、食用和药用菌生产、饲料工业及医药卫生等各个领域有着广泛应用。而利用微生物发酵合成酪氨酸酶也已成为研制治疗白瘫风、帕金森病和老年痴呆症等疾患药物的努力方向。随着科学技术的进步，多酚氧化酶的应用技术会越来越广泛，这就对多酚氧化酶的提取纯化技术提出了要求。签{Nelumbo nucifera, feerto.),是多年生草本植物,分布于世界各地,尤其以中国、印度和日本的栽种面积最广。我国是莲生产面积最广的国家，栽种区域主要分布于福建、江西、湖北和安徽等省份。莲蓬，是莲子生产过程中产生的副产物，一般被农户或生产商丢弃，造成很大的资源损失和环境污染。莲蓬富含多酚氧化酶，是多酚氧化酶的良好生物来源。莲蓬的蛋白含量比较低，从莲蓬中提取多酚氧化酶，减少了杂蛋白分离的难度。另外，提取过程中主要的干扰成分是一些水溶性的多酚或者生物碱成分，分子量较小，易于分离，这就保证了多酚氧化酶较高的提取率。这些优点是目前一些从果蔬或者发酵产物提取多酚氧化酶无法比拟的。该专利技术采用的方法提取所得的多酚氧化酶具有非常高的纯度(97%以上)，为其在生物医药等领域的利用提供了工业生产的可能。总之，这种多酚氧化酶的提取利用的方法具有较高的社会价值和经济价值
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术是通过以下技术方案实现的。本专利技术所述的，按如下步骤。(I)提取缓冲溶液的制备在0. r1. OmoI/L pH 5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液中加入Triton X-100、聚乙二醇和NaCl等破壁剂制得提取缓冲溶液，使该提取缓冲溶液含TritonX-100 0 5 g/100mL、聚乙二醇 0 5 g/100mL、NaCl 0.1 2. 0 g/100mL，2°C 5°C冷却处理。(2)取新鲜的或冷冻保藏去籽莲蓬，撕碎或切片，按照1:广1:5的料液比(g/ml)加入步骤(I)中的提取缓冲溶液，冰浴或冷冻等低温环境下匀浆后，超声波处理l(T20min，浆体在4°C 常温下静置2(T60min，静置过程中搅拌3飞次，过滤浆体，取清液；所得的清液在4°C 20°C条件下低温离心l(T20min，离心速率为4000^，弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末使其达到3(T40%的饱和度，4°C 20°C低温条件下离心 2(T40min，离心速率为8000 1300(^，弃去沉淀物，保留上清液；继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到70 80%的饱和度，4°C 20°C条件下离心3(T60min，离心速率为1000(Tl500(k，弃去上清液，保留沉淀物；沉淀物用少量的0. r1. OmoI/L pH 5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物。(3)将步骤(2)的粗提物分装于经过常规预处理的截留分子量l(T25kDa的透析袋，以水或者0. f0.3mol/L pH 5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液作为透析液，4°C条件下透析5^20h除盐。通过截留分子量l(T25kDa的超滤至合适的体积，即得到多酚氧化酶的粗提物。(4)将步骤(3)的多酚氧化酶粗提物按照上样体积柱床体积=l:l(Tl:50的比例，经过离子交换树脂柱，分别用水和0. 2^1. 0mol/L的梯度NaCl溶液洗脱；以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，收集酶活最高的占体积总量20-30%的洗脱液。再经凝胶柱用相同方法的洗脱和收集，得到酶活最高的占体积总量20-30%的洗脱液。用步骤(3)中方法透析处理，经过超滤或冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶。本专利技术步骤(I)所述的缓冲溶液中加入了破壁剂。本专利技术步骤(4)所述的离子交换树脂柱为DEAE-Sephadex A-25或DEAE-纤维素。本专利技术步骤(4)所述的凝胶柱为Sephacryl S-200或Sephadex-GlOO。经电泳检测，其纯度高达95%以上。取1. 95 ml PBS (pH 6.8，0. 2mol/L)，0. 5 ml浓度为20mmol/L儿茶素为底物，加入酶35iig，于35°C反应10 min，420nm处测定OD值，所测酶活符合米氏方程的酶反应动力学(Km=O. 0105mol/L)。定义I个酶活单位(U)为在以上测定条件下Imin引起的吸光度值改变0. 001所需的酶量。测得该酶的最大反应速度为Vmax=2. 58 X IO5 3. 96 X IO5 (U/min.g 酶)。经上述步骤提取的多酚氧化酶，提取率可达到约10mg/100g (纯酶/原料)，纯度可达95%以上，提取所得的酶的最大反应速度约为3. 5X105(U/min*g酶)。本专利技术解决了莲蓬副产物的利用问题，能提高莲产物的经济附加值，另外经过该专利技术获得的多酚氧化酶具有较高的纯度(95%以上)，得到的多酚氧化酶可广泛应用于食品和药品的生产与加工。附图说明图1为本专利技术提取所得的莲多酚氧化酶的SDS-PAGE电泳图谱。A :经过硫酸铵沉淀后得到的莲多酚氧化酶；B :经过DEAE-Sephadex A-25柱层析后得到的莲多酚氧化酶；C 经过Sephacryl S-200凝胶柱层析后得到的莲多酹氧化酶；D :蛋白质Marker。图2为本专利技术提取所得的未失活的莲多酚氧化酶的圆二色谱图及二级结构组成结果。图3为本专利技术提取所得的失活后的莲多酚氧化酶的圆二色谱图及二级结构组成·结果。图4为本专利技术提取所得的莲多酚氧化酶对温度的耐受度。图5为本专利技术提取所得的莲多酚氧化酶对pH的耐受度。图6为本专利技术提取所得的莲多酚氧化酶对乙醇的耐受度。具体实施例方式本专利技术将通过以下实施例作进一步说本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，其特征是按如下步骤：（1）提取缓冲溶液的制备：在0.1~1.0mol/L?pH?5.0~8.0的磷酸盐缓冲液中加入Triton?X?100、聚乙二醇和NaCl等破壁剂制得提取缓冲溶液，使该提取缓冲溶液含Triton?X?100?0~5?g/100mL、聚乙二醇0~5?g/100mL、NaCl?0.1~2.0?g/100mL，2℃~5℃冷却处理；?(2)取新鲜的或冷冻保藏去籽莲蓬，撕碎或切片，按照1:1~1:5的料液比（g/ml）加入步骤（1）中的提取缓冲溶液，冰浴或冷冻等低温环境下匀浆后，超声波处理10~20min，浆体在4℃~常温下静置20~60min，静置过程中搅拌3~5次，过滤浆体，取清液；所得的清液在4℃~20℃条件下低温离心10~20min，离心速率为4000g，弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末使其达到30~40%的饱和度，4℃~20℃低温条件下离心20~40min，离心速率为8000~13000g，弃去沉淀物，保留上清液；继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到70~80%的饱和度，4℃~20℃条件下离心30~60min，离心速率为10000~15000g，弃去上清液，保留沉淀物；沉淀物用少量的0.1~1.0mol/L?pH?5.0~8.0的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物；(3)将步骤（2）的粗提物分装于经过常规预处理的截留分子量10~25kDa的透析袋，以水或者0.1~0.3mol/L?pH?5.0~8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，4℃条件下透析5~20h除盐；通过截留分子量10~25kDa的超滤至合适的体积，即得到多酚氧化酶的粗提物；?(4)将步骤（3）的多酚氧化酶粗提物按照上样体积：柱床体积=1:10~1:50的比例，经过离子交换树脂柱，分别用水和0.2~1.0mol/L的梯度NaCl溶液洗脱；以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，收集酶活最高的占体积总量20?30%的洗脱液；再经凝胶柱用相同方法的洗脱和收集，得到酶活最高的占体积总量20?30%的洗脱液；用步骤（3）中方法透析处理，经过超滤或冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶。...

【技术特征摘要】
1.一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，其特征是按如下步骤 (I)提取缓冲溶液的制备在O. f1. Omol/L pH 5. (Γ8. O的磷酸盐缓冲液中加入Triton X-100、聚乙二醇和NaCl等破壁剂制得提取缓冲溶液，使该提取缓冲溶液含TritonX-1OO 0 5 g/100mL、聚乙二醇 0 5 g/100mL、NaCl O. Γ2. O g/100mL，2°C 5°C冷却处理； (2)取新鲜的或冷冻保藏去籽莲蓬，撕碎或切片，按照1:5的料液比(g/ml)加入步骤(I)中的提取缓冲溶液，冰浴或冷冻等低温环境下匀浆后，超声波处理l(T20min，浆体在4°C 常温下静置2(T60min，静置过程中搅拌:Γ5次，过滤浆体，取清液；所得的清液在4°C 20°C条件下低温离心l(T20min，离心速率为4000^，弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末使其达到3(Γ40%的饱和度，4°C 20°C低温条件下离心2(T40min，离心速率为800(Γ 3000^·，弃去沉淀物，保留上清液；继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到70 80%的饱和度，4°C 20°C条件下离心3(T60min，离心速率为1000(Tl500(k，弃去上清液，保留沉淀...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓泽元，谢汝朋，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：