一种牛蒡子苷元的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种牛蒡子苷元的制备方法，所述方法包括：以牛蒡子苷为底物，以黑曲霉ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２５９４发酵产生的β－葡萄糖苷酶酶液为催化剂，于２０～５０℃、１００－２００ｒ／ｍｉｎ摇床中转化４０～６４小时，转化液经分离纯化得到所述牛蒡子苷元。本发明专利技术的有益效果主要体现在：①反应条件温和，环境友好；②生物催化剂－－β－葡萄糖苷酶酶液制备过程简单、不需要复杂的酶蛋白的分离纯化，成本低廉；③操作简便、生物转化效率较高；④生物转化过程易于放大，易于实现大规模工业化生产。利用本发明专利技术方法生产的牛蒡子苷元摩尔产率可以达到９４．７％，产品纯度可达到９９．７％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，尤其是一种以黑曲霉CGMCC No.2594发酵产生的(3-葡萄糖苷酶酶液为生物催化剂制备牛蒡子 苦元的方法。(二)
技术介绍
牛蒡子苷元((-)-Arctigenin)，分子式为C21H2406,分子量372.41。牛 蒡子苷元具有治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化、抗病毒、抗肿瘤等 功效，在自然界存在于牛蒡子中。牛蒡子是菊科植物牛蒡(Arctium Lappa L.)的干燥成熟果实。牛蒡子发挥药效的有效成分为木质素类化合物—— 牛蒡子苷和牛蒡子苷元,其中牛蒡子苷必须先经过代谢转化为牛蒡子苷元 才能被人体吸收。因此，牛蒡子苷元是可以被人体直接吸收的有效成分。 牛蒡子苷元的制备主要有两种方法 一种是从中药牛蒡子中分离提 取。牛蒡子苷元在牛蒡子中的含量低于1%,因此牛蒡子苷元的产品得率 较低。另一种是生物法合成。广州中医药大学胡英杰等人采用蜗牛酶成功 地将牛蒡子苷水解为牛蒡子苷元，为牛蒡子苷元的酶法合成提供了思路， 纯酶的分离提取过程工艺较为复杂成本较高。牛蒡子苷的糖苷键水解断裂可以产生牛蒡子苷元。P-葡萄糖苷酶 (beta-Glucosidase )可以催化糖苦^T建的断裂。P-葡萄糖苦酶系统名称为 (3-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase; EC 3.2丄21)。广泛存在于植物、酵母、曲霉菌、木酶菌及细菌体内，利用(3-葡萄糖苷酶产生菌发酵产酶水解牛蒡子苷可以制备牛蒡子苷元。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用黑曲霉CGMCC No.2594发酵产生的卩-葡萄糖苷酶转化牛蒡子苷合成牛蒡子苷元的方法。本专利技术的技术方案是，所述方法包括在以牛蒡子苷为底物， 以黑曲霉CGMCC No.2594发酵产生的|3 -葡萄糖苷酶酶液为催化剂的反 应体系中，于20~50°C 、 100-200 r/min摇床中转化40 64小时，转化液经 分离纯化得到所述牛蒡子苷元。所述发酵可在常规适用于黑曲霉发酵的培 养基和操作条件下进行，所述(3-葡萄糖苷酶酶液用量以足以使底物牛蒡 子苷全部转化为宜，亦可过量。黑曲霉CGMCCNo.2594,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编 号CGMCC No.2594，保藏日期2008年7月15日。该菌林已在本申请人 的在先申请CN200810120902.3中作为新菌种予以保护。所述黑曲霉CGMCC No. 2594是从浙江工业大学校园内运河附近的 土壤中筛选得到。所述黑曲霉CGMCC No. 2594的菌落特征菌落在查 氏培养基上25。C培养7 10天，直径50 80mm。菌丝绒毛状，分生孢子 结构呈黑色，无渗出液，无气味。菌落反面略带浅黄色，有同心圓褶皱 2~3圈，辐射状褶皱5~6条。所述的底物牛蒡子苷在反应体系中的初始浓度为0.3 1.5mmol/L。所述反应体系中还可添加Mg"以提高反应产率，优选的，所述反应体系中添加100 400 mmol/L (优选200 mmol/L )的MgS04 。具体的，所述P-葡萄糖苷酶酶液由如下方法制备得到将黑曲霉CGMCC No.2594接种至适用于黑曲霉的发酵培养基进行发酵培养，获得的发酵液过滤，取滤液调节滤液pH值为3 11,即为所述(3-葡萄糖苷酶酶200810液(制备得到酶液的酶活约为10 75U/mL,牛蒡子苷浓度0.3 1.5mmol/L 的底物溶液为10mL时， 一般添加10 30mL酶液即可)，所述P-葡萄糖苷酶 酶液用量以酶液中P-葡萄糖苷酶总的酶活力计为5000 250000 U/mmol牛 蒡子苦(此处酶活是以初始酶活计，因为在反应过程中，随条件的不同， 酶活是变化的)。P-葡萄糖苷酶活力测定方法以对硝基苯酚-(3-D-葡萄糖 苷(/ NPG)为底物。测定时，取O.l ml适当稀释的酶液与O. 9ml、 5 mmol/L pNPG溶液混合(酶液稀释及/ NPG的配制均采用50 mmol/L、 pH 4. 8柠檬 酸-磷酸氢二钠緩冲液)，于50 。C下保温10min。然后立即加入2ml的l mol/LNa2C03溶液终止反应，再加入IO ml的蒸馏水摇匀，在400nm下测 定吸光度。定义每分钟水解生成ljimol对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶 活力单位(U)。所述发酵培养基为常规适用于黑曲霉的发酵培养基，本专利技术中所述发 酵培养基组成如下稻草粉30~60 g/L，麦麸10~20 g/L,大麦粉10 20 g/L, (NH4 ) 2S04 8~12 g/L, KH2P04 0. 2 0.6 g/L, MgS04.7H20 0. 2~0.6 g/L， pH 5.0。所述分离纯化方法可按照本领域常规方法进行，本专利技术中所述分离纯 化方法如下反应结束后，取转化液加入体积为反应液体积8倍的甲醇终 止反应，放置过夜，过滤取滤液减压蒸干，蒸干后的残留物加入氯仿溶解 后，加无水硫酸钠脱水、过滤、减压蒸干得到主要含有牛蒡子苷元的混合 物，所述混合物再用硅胶柱分离牛蒡子苷元，洗脱剂为氯仿、曱醇体积比 100: 0 95: 5的混合液，洗脱液以曱醇重结晶，得到所述牛蒡子苷元。具体的，所述方法按如下步骤进行(1 )斜面培养称取马铃薯200 g,洗净去皮切碎，加水1000 ml煮 沸半小时，纱布过滤，加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，lx105 Pa灭菌30 min,摆放斜面、 冷却，得到斜面培养基；斜面培养基接种黑曲霉CGMCC No.2594， 30。C培养7d,得到斜面菌种； (2 )液体发酵培养基组成稻草粉50 g/L，麦麸15 g/L，大麦粉15 g/L, (NH4 ) 2S04 10 g/L, KH2PO40. 5 g/L， MgS04.7H20 0. 5 g/L,起 始pH 5. 0;以生理盐水冲洗步骤(1)所得斜面菌种，得到孢子 悬液接种至液体发酵培养基，30 。C、 150r/min摇床培养5 9d, 得到的发酵液过滤，取滤液调节滤液pH值为3 11,得到(3-葡 萄糖苦酶酶液；(3) 底物牛蒡子苷溶解于无菌水中得到底物溶液，取P-葡萄糖苷酶 酶液与底物溶液充分混合得到混合液，牛蒡子苷在混合液中初 始浓度为0.3 1.5mmol/L，所述P-葡萄糖苷酶酶液用量以酶液中 卩-葡萄糖苷酶总的酶活力计为5000~250000 U/mmo1牛蒡子苷， 并在混合液中添力。200 mmol/L的MgS04;混合液置于30°C、 150 r/min的摇床中反应48 h;(4) 反应结束后，加入体积为转化液体积8倍的曱醇终止反应，放 置过夜，过滤取滤液减压蒸干，蒸干后的残留物加入氯仿溶解 后，加无水硫酸钠脱水、过滤、减压蒸干得到主要含有牛蒡子 苷元的混合物，所述混合物再用硅胶柱分离牛蒡子香元，洗脱 剂为氯仿、曱醇体积比100: 0 95: 5的混合液，洗脱液以曱醇 重结晶，得到所述牛蒡子苷元。本专利技术直接采用黑曲霉CGMCC No.2594发酵产生的p-葡萄糖苷酶 酶液水解牛蒡子苷制备牛蒡子苷元，不需要(3-葡萄糖苷酶的分离提取与 纯化，为牛蒡子普元的制备提供一条方便有效的途径，反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛蒡子苷元的制备方法，所述方法包括：在以牛蒡子苷为底物，以黑曲霉ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２５９４发酵产生的β－葡萄糖苷酶酶液为催化剂的反应体系中，于２０～５０℃、１００－２００ｒ／ｍｉｎ摇床中转化４０～６４小时，转化液经分离纯化得到所述牛蒡子苷元。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：欧志敏，杨根生，应国清，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]