本发明专利技术提供解淀粉类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）Ｐ１７菌株，以及以该菌株为原料分离纯化所得的低温果胶酶及其分离纯化方法。该方法包括粗酶液的制备、硫酸铵盐析、阴离子交换层析、阳离子交换层析后，收集有活性的组分保存，即得纯酶。本发明专利技术的低温果胶酶由于在低温条件下的活性好、对金属离子耐受性较好、对有机溶剂耐受性较好和对高酯化度的果胶底物具有很高的专一性，可广泛应用于冷洗涤行业、重金属污染废水处理、水果加工业、纺织、制浆造纸等工业领域。
【技术实现步骤摘要】
,由其所得的低温果胶酶及其分离纯化方法
本专利技术属于微生物
，具体地，涉及解淀粉类芽孢杆菌(/^em'&w77"s a/7 j^o7y"c"s) P17菌株，由其产生的低温果胶酶及其分离纯化方法。 背景駄-果胶酶(Pectinases， EC. 3. 2. 1.15)是指能够分解果胶质(由D-半乳糖醛酸 以a - 1， 4,键连接形成的直链聚合物，部分被甲酯化)的，由多种酶组成的一 类复合酶，它广泛存在于高等植物、昆虫和微生物中。果胶酶主要有两种分类方法 1)根据底物优先法、水解类型和降解方式可以分为原果胶酶、果胶酯酶、果胶解 聚酶2)根据最适作用pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。果胶酶主要应用于食品业，尤其是水果加工业，它可以有效地提高水果的出汁 率，改善果汁的过滤效率，减少化学澄清剂的用量，改善果汁质量，简化果汁加工 工艺，縮短加工时间，提高生产效率、果汁产量和产品质量的稳定性。此外，果胶 酶还可以应用于纺织、制，纸、麻类脱胶、木材防腐，甚至有报道用于治疗胃结 石等领域。低温果胶酶的发现不仅为果胶物质的低温降解提供了可能，而且扩展了果胶酶 的工业应用范围。低温果胶酶多由低温微生物产生。Lund等人在研究果蔬腐坏病过 程中发现了微生物果胶酶，在以后的几十年里，国内外研究者对微生物果胶酶进行 了大量的研究，fM)^微生物低温果胶酶的研究则起步较晚，主要研究都集中在最近 十多年。国内对低温果胶酶的研究工作刚冈岍展，有关低温果胶酶的研究鲜有报道。 国外对低温果胶酶的研究主要集中在菌种筛选、鉴定、理化性质分析方面。Takasawa 等从小麦幼苗中分离得到的嗜冷性核盘菌(6Wew"/7J's力or朋7is)产生低温聚半 乳糖醛酸酶，最适酶活温度40 5(TC，最适pH4.5，在5。C仍有最大活性的30%， 室温过夜或5(TC保温30min活性损失明显，6(TC活性弱。Laurent等从储存于冷库 的根芹菜腐烂部位中分离出产生三种果胶酸裂解酶同工酶(PL I 、 PLII和PLIID的浅黄金色单胞菌(0 2Tseoyz o/7as JWeoh)。 Truong等从南极冰水中首次分离出一 株产低温果胶酶的海洋微生物/^Woa"e2^ 朋as力s7o; 7aM"s，该菌株能产生两 种具有低温果胶酸裂解酶活力的酶，最适酶活温度30。C，最适pH分别为9和10。Miura， et al.从深海沉积物中分离的新型隐球酵母菌(6bT toco""sN6)产生的两种低 温聚半乳糖醛酸酶(P36和P40)，最适作用温度为5(TC，在(TC分别保持有最高活 性的25%和30%。 P36和P40对压力有很好的耐受性，所受的压力缓慢升到100Mpa时， 酶活力没有发生变化。Birgisson， et al.从冻土、被冻结的树叶或树枝中分离得 到8株分泌胞外冷活性聚半乳糖醛酸酶的酵母，并对其中四株酵母进行了产酶条件 的研究。最近关于微生物低温果胶酶的报道，来自于Margesin， et al，关于两株木 克拉酵母(*a^'a /W^Va A15和AG25)的研究。A15和AG25分别分离自高山冰川的冰尘和西伯利亚北部地区的沉积物中，它们的驗产酶温度分别为5。c和rc，其产酶温度均低于它们的最适生长温度。Margesin等对M^ria /i^7'血A15和AG25产 生的低温果胶酸裂解酶研究表明，最适酶活温度3(TC，最适pH分别为9.0和8.5，在 0°。分别保持有最高活性的21°/。和16%， Ca2+是两种酶活性的必须金属离子。由于低》显 果胶酶在低温下仍能保持较高的活力和对热敏感等特点已弓l起众多学者的广泛关 注，已成为近年酶学研究的一个热点。因此，对低温果胶酶的研究不仅在理论上有 着重要的意义，而且在工业应用上也具有巨大的潜在价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株产生低温果胶酶的菌株P17，经16SrRNA鉴定，将此 菌株初步鉴定为解淀粉类芽孢杆菌(/^e77^^i"〃s柳j^77"c〃s)。本专利技术的另一 目的是提供一种在低温斜牛下具有较高活性的低温果胶酶及其 分离纯化方法。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案 解淀粉类芽孢杆菌(尸ae/7J'/7aci"〃s湖^o^"c〃s) P17菌株，菌种保藏号为 CGMCC No. 2640。低温果胶酶，从解淀粉类芽孢杆菌(尸ae加'/^!72〃s柳j^&"ms) P17菌株 产生，其酶学性质为最适反应温度为4(TC，并在0-l(TC保持稳定；最适pH为8. 0，在pH6.0-10.0保持禾急定；Mg2+、 Na+、 Zn，口 Cd2+对其有激活作用，Li+、 Cu2+、 Mn2+、 Ca2+、 Fe2+、 Ba2+、 Ni2+、 Pb2+、 Co2+、 Al3， Fe3+对酶有轻微的抑制作用，&2+对酶有显 著的抑制作用；鳌合剂EDTA和变性剂SDSX寸其有抑制作用；丝氨酸蛋白酶专一抑 制剂苯甲基磺酰氟化物对其没有抑制作用；其酶活力随着有机溶剂如甲醇、乙醇、 丙酮和乙腈浓度的升高而提高，当浓度达到一定值50%时，随着其浓度的升高低温 果胶酶活力反而下降；10°/魂度的二甲基亚砜对酶有激活作用，但随着其浓度的升 高，对低温果胶酶有抑制作用；10%浓度的甲醛对酶表现出较强的抑制作用；随着 果胶酯化程度的增加，酶活力表现出相应的提高，其最适底物为90%酯化度的果胶； 但该酶不能降解多聚半乳糖醛酸；低温果胶酶在4'C时的Km值为0.233mg/mL，远 远低于其最适温度40。C时的Km值1. 362mg/mL。 .低温果胶酶，从解淀粉类芽孢杆菌(尸aem'Aaci77"s a/^化7j^ic^) P17经下 述纯化方法获得粗酶液的制备将解淀粉类芽孢杆菌菌株P17接种于液体发酵培 养基中，培养至稳定期初期，离心，过滤，收集上清液；硫酸铵盐析往粗酶液中 加入硫酸铵，离心取上清，再加入硫酸铵，离心取沉淀,在上样缓冲液中透析；阴 离子交换层析酶液上样，收集有活性的透过液；阳离子交换层析酶液上样，洗 脱，收集有活性的组t2(TC甘油保存，即纯酶。低温果胶酶，从解淀粉类芽孢杆菌(尸ae/7ifecW7〃s a/^Jo^r"c〃s) P17经下 述纯化方法获得将解淀粉类芽孢杆菌菌株P17接入液体LB培养基中，在13 25 °C的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养 基中，13 25'C振荡培养至稳定期初期即为产酶高峰期，将发酵液离心，取上清， 滤纸过滤，得粗酶液；用截留分子量为10KDa的膜包将粗酶液的体积浓縮至原来的 1/10;浓縮后的酶液加硫酸铵至60% 70%饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至 90% 100%，离心取沉淀，在pH8.0的KPB缓冲液透析过夜；将透析后的酶液离心， 取上清液，上样于已用pH8.0的KPB缓冲液平衡好的DEAE-S印harose预装柱，收 集有活性的透过峰酶液，并用截留分子量为10KDa的 管进行浓縮；用pH6. 0的 KPB缓冲液将 酶液透析过夜，离心取上清，上样于已用pH6.0的KPB缓冲液平 衡好的CM-S印harose预装柱，洗脱，收集有活性的部分，即为纯酶。解淀粉类本文档来自技高网...
【技术保护点】
解淀粉类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）Ｐ１７菌株，菌种保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２６４０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏云林，王大拓，季秀玲，井申荣，林连兵，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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