本发明专利技术提供了一种在红景天原药材的固态培养料中，用微生物混合菌株进行转化发酵以提高红景天原药材中活性成分的方法。该方法是将用红景天根茎粉制成的红景天固态培养料，经灭菌后接种微生物混合菌株进行固态发酵培养。通过本发明专利技术方法的转化发酵可使红景天活性成分比原药材中的活性成分大大提高，使其含量最高可比原药材提高７０％以上，因而能有效利用野生资源，同时还能减少药渣等污染物的排量，实现藏中药的保护性开发，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于从红景天藏中药材中提取有效活性成分的
，具体涉及一种用 微生物混合菌株制备红景天固态转化发酵物的方法，该发酵物中的有效活性成分大大 提高。
技术介绍
红景天是指景天科红景天属植物，在世界上有90余种，多分布在北半球的高寒地 带，大多数都生长在海拔3500-5000米左右的高山流石或灌木丛林下。我国现发现有 73种，主要分布在我国西藏的高山高寒地带，另外东北、西北、华北的一些地区也有 红景天资源分布。红景天的主要药用部位是根茎，其中所含的主要有效成份红景天甙和酪醇(甙元)， 具有抗疲劳、抗缺氧、抗诱变和抑制肿瘤等功效，且无副作用(宋月英等，红景天属植 物化学成分及药理作用的研究进展中草药.2004, 35(2).-235-236;李刚等藏药红景天 的药理学研究进展中国民族医药杂志.2004,10(3).-38-40;王家明闰继平王盛虔 红景天的药理作用研究进展中医药学报.2003,31(4),57-59),因此，在药品和保健食 品的开发中得到了广泛的应用。由于对红景天的大量开发利用，使这种高原藏区野生药材资源已面临枯竭的危机。 而目前采用的红景天活性成分制备工艺大多是用醇类(乙醇等)直接浸泡红景天原料 进行提取。这种方法只能提取其中存在的有效活性成分，而其中的有效活性成分含量 又很低，如红景天苷的含量约为0.6~0.7%。面对大量的社会需求，如何在当前提取法 的基础上开发新的制备方法，以提高红景天原药材的利用率，己成为当前本领域急需 解决的问题。已报道的新工艺方法有化学合成法，植物细胞组织培养法以及用单一菌 株的微生物转化法。这些方法均是在醇类提取工艺之前，欲通过不同来源获得或增加 有效成分，期望减少野生资源的用量。其中微生物转化法从提高红景天本身的有效成 分来说是最具应用前景的方法，如专利申请"一种微生物转化制备红景天提取物的方 法"(申请号200610146107.2 )公开的技术是采用单一微生物菌株进行转化发酵。虽 然该方法能提高红景天本身的有效成分，但因其最高只能提高有效活性成分含量约30%，故提高有限，还不够理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对已有的采用单一微生物菌株进行转化发酵提高红景天有效成 分方法存在的缺陷，提供一种， 该方法能大幅提高红景天原药材中有效活性成分，在利用同等量原药材的条件下，能 获得更多的提取产物，使野生藏中药材得到充分利用。本专利技术提供的用微生物混合菌株制备红景天液固态转化发酵物的方法，该方法的' 工艺步骤和条件为1) 将红景天根茎粉碎至60 120目，优选80 120目，更优选80目；2) 在每100份的红景天粉中加入80~120份水，优选90 100份，更优选100份， 0.05 0.2份酵母膏，优选0.1 0.2份，更优选0,2份，0.05 0.2份磷酸二氧钾，优选 0.1 0.2份，更优选0.2份，和0.02 0.05份硫酸镁，优选0.03 0.04份，更优选0.03 份，搅拌混合均匀，使之成为红景天固态培养料，并灭菌；3) 在红景天麸皮种子培养基中，分别制备曲霉属中的黑曲霉^^^^//^"/取/^和 米曲霉(^ype "gz7/iw o 7加e)的菌丝培养物；4) 将制备的两种霉菌的菌丝培养物按重量比2 8 : 8~2混合后，再将混合菌丝 培养物接种于红景天固态培养料中，接种量按每100份红景天粉计接种5 20份(湿 重)；5) 将接种后的制备物在温度28 32'C下保温培养发酵48 60小时，优选温度30 °C，培养时间60小时即可，以上接种的菌丝培养物的湿重，是培养2天后的菌丝培养物自然含水的总重。 该方法中对红景天固态培养料灭菌可在常规条件下进行，如在温度121'C灭菌30 分钟。该方法中所用的菌丝培养物是这样培养的先将粒径为80目的红景天粉、麸皮与 水按重量份0.8 : 0.2 : 1混合拌匀后，蒸汽灭菌，即成为红景天麸皮种子培养基。然后 在红景天麸皮种子培养基中分别接入曲霉属"^erg///^)中的黑曲霉04i;pe^7/^ m'ger) 和米曲霉04wergz7/Moo^加)的孢子，在3(TC温度下培养2天，即成为菌丝培养物。其中所用的两种霉菌既可采用已有的曲霉属(^pwg///^)中的黑曲霉 <^y;^g///w1yw/ger)和米曲霉(J^erg///^ 07加e),也可采用本专利技术人从野生红景天药材 中分离纯化和筛选后得到的，优选后一种。本专利技术人从野生红景天药材中分离纯化和筛选后得到的黑曲霉(^5^^7/^"/^1:)和米曲霉(A;^gi7/^ oz7加e)的具体方法是将 天然野生红景天药材捣碎，取lg，加入5ml无菌水，震荡摇匀，再用无菌水分别稀释 10、 100、 1000和10000倍。将以上各稀释液分别取O.lml,涂布于分离培养基中，经 3(TC培养3天，挑取单菌落，选择在红景天培养基中转化发酵后，用高效液相色谱 (HPLC)检测，红景天苷含量提高的菌株。分离培养基配方是葡萄糖10g、蛋白胨 5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾lg、硫酸铵0.5g、琼脂20g和水1000ml。所分离出的两种 霉菌根据常规方法鉴定为曲霉属U^eA^7細)中的黑曲霉(Aspergz7/w^/ge。和米曲霉对于红景天植物中的主要有效活性成分红景天苷的含量，中国药典2005年版一部 规定药材中红景天苷的含量应>0.5%，而经实测天然红景天原药材中红景天苷的含量 约为0.6~0.7%。现有的红景天苷提取物的制备工艺是采用醇类(乙醇等)直接浸泡提 取，故只能提取已经存在的红景天苷。由于红景天的主要有效活性成分红景天甙及酪 醇(甙元)的合成属于次级代谢，酪醇及红景天甙是在酚性结构基础上分别加上乙醇 基和葡萄糖基所形成。本专利技术人在研究红景天的主要有效活性成分红景天甙及酪醇(甙 元)时，发现红景天植物中存在着一定的可转化的前体，因而根据微生物具有丰富的 的代谢多样性和很强的代谢能力，并具有在高等植物体内存在的代谢途径，曾提出了 用微生物的酶系来催化红景天原料中无活性的前体，使之与葡萄糖基及乙醇基等成分 合成酪醇及红景天甙，以提高红景天甙及酪醇(甙元)含量的技术方案(专利申请号 200610146107.2)。该技术方案的原理如附图所示。但由于该方法采用的是单一菌株，虽然能提高有效活性成分的含量，但其提高量 较为有限。本专利技术人在进一步研究中，大胆打破"使用混合酶发酵比单一酶效果更差" '的惯性思维，进行了创造性的探索，提供了上述用曲霉属中的黑曲霉(^!^^///"5"/取^ 和米曲霉(^pe^7to W7z"e)两种微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法。 该方法能大幅提高红景天原药材中有效活性成分，使红景天苷的含量最高可比原药材 提高70%以上，因而在利用同等量原药材的条件下，能获得更多的提取产物，使野生 藏中药材得到充分利用。由于经本专利技术方法发酵处理后所得的转化发酵物中红景天苷的含量最高可比原药 材提高70%以上,，因而在获得同等量产物时，可减少原药材消耗。且还可通过以下经 济效益的分析计算中看出，单菌株转化法增效处于盈亏平衡点附近;而本方法增效是 单菌株转化法的4.7倍，具有很强的应用前景按红景天苷同等含量计算，直接用乙醇本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用微生物混合菌株制备红景天固态转化发酵物的方法，该方法的工艺步骤和条件为： １）将红景天根茎粉碎至６０～１２０目； ２）在每１００份的红景天粉中加入８０～１２０份水，０．０５～０．２份酵母膏、０．０５～０．２份磷酸二氢钾和０ ．０２～０．０５份硫酸镁，搅拌混合均匀，使之成为红景天固态培养料，并灭菌； ３）在红景天麸皮种子培养基中分别制备曲霉属中的的黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）和米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）的菌丝培养物； ４）将制备的两种霉菌的菌丝培养物按重量比２～８∶８～２混合后，再将混合菌丝培养物接种于红景天固态培养料中，接种量按每１００份红景天粉计接种５～２０份（湿重）； ５）将接种后的制备物在温度２８～３２℃下保温培养发酵４８～６０小时 即可， 以上所用物料份数均为重量份。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓小晨，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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