一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括：向灭菌过的培养液中接入黄绿密环菌ＺＪＵＱＨ，得到预反应体系；再加入含有白桦脂醇的底物溶液，于２５～３０℃转化反应５～７天得到转化后的培养液，经后处理得到白桦脂酸，其中白桦脂醇用量以每升培养液计为０．０１～０．１ｇ。该方法与直接植物提取白桦脂酸法和化学合成白桦脂酸法相比，主要优点是微生物细胞培养时间短、操作简便、易于控制，整个生物转化周期较短，转化过程安全可靠，成本低，适于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种利用微生物转 化反应合成白桦脂酸的方法。
技术介绍
白桦脂醇(betulin, lup-20(29)-ene-3卩，28-diol)和白桦脂酸(betulinic acid， 3(3-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)属羽扇烷型三萜类化合物，在 自然界中广泛存在，其最丰富的自然资源是白桦树(&,w/"印; .)。近年科 学研究发现，白桦脂醇和白桦脂酸是非常有价值的天然产物。白桦脂醇、 白桦脂酸及其衍生物作为生物制剂在抗艾滋病(HIV)和癌症治疗等方面 表现出了巨大的潜能，并显示出了与以往药物不同的作用机制。因此，对 白桦脂醇和白桦脂酸及其衍生物的研究已成为近年来天然有机药物研究 的热点。尤其是白桦脂酸，具有宽范围的生物学以及药理学活性，具有抗 痴性、抗炎性和抗肿瘤活性，尤其在抗艾滋病活性及抗各种肿瘤细胞系细 胞毒性方面可与一些临床用药相比，已被视为最有潜力的新型药物制剂。 在我国，白桦分布范围广，植物资源丰富，但研究开发甚少。研究我国白 桦资源，对于我国资源的开发、天然药物的研究都具有非常重要的意义。生物转化是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器， 以及游离酶对外源性化合物进行结构》务饰的生化反应。 一方面天然产物一 直是人类寻找有效活性成分的源泉；另一方面在开发新药过程中，以天然 产物为先导化合物，通过化学或生物的手段，对其结构进行^务饰，得到更 多结构新颖的化合物，进而发现毒性更低、疗效更好的药物。微生物作为 一个完整个体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。同时由于微生物资源丰富，种类繁多，对于特异的底物，可供筛选的菌4朱《艮多。 以多种不同催化功能的酶系对天然活性成分进行生物转化，可产生新的组 合性的天然化合物库，再通过活性筛选，可寻找新的高效低毒的天然活性 先导化合物，或通过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系 的分析发现关^T建活性成分。而利用微生物转化可以发现新一代的先导化合 物，已取得了巨大的社会效益和经济效益。生物转化规律还可以指导新药 的结构修饰，获得高效长效的新一代药物，足以说明生物转化对新药开发 的重要性。微生物转化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰， 也就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一 系列的酶对底物进行催化 反应，是近年来新兴起的获得目标产物的又一途径。；徵生物转化具有许多 优点，譬如，微生物倍增时间短，生物量积累快，从而产生的酶量就相应较多，转化时间短；微生物的基因工程研究工作成熟，转化酶的高效表达 成为可能；微生物发酵工艺成熟，便于工业化生产。随着现代提取、分离、 鉴定手段的进步，使微生物技术的应用不再局限于传统酿造及小分子化合 物的转化，正广泛地应用于药物前提化合物的转化、生物催化的不对称合 成、光学活性化合物的拆分、新药开发、药物代谢体外模型预测等领域， 已成为生物转化技术中发展最为迅速的分支之一。微生物作为一个完整的 生命体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。在它生长过程 中有许多酶的参与，如合成酶、水解酶、异构酶、氧化酶、还原酶等，它 们都可能对加入其中的底物发生作用，使其结构发生变化。同时由于微生 物资源丰富，种类繁多，对于特异的底物可供筛选的菌抹很多。利用微生 物还可以模仿生源合成途径，合成贵重药品或者其它化学合成前提，提高 原料利用率，有效延緩资源消耗。如，美国施贵宝公司利用微生物转化进 行紫杉醇的合成，他们分别从A^caniz'c^es a/6w SC 13911, A^carafc/cfe /wtew SC 13912, Morace〃a平三种微生物的发酵液中分离出C-13 taxolas, C-7 xylosidase， C-10 deacetylase,分别将红豆杉中的几种紫杉烷的7、 10、13位进行水解，得到较多而单一的10-去乙酰-Baccatin II,该产物为紫杉 醇合成的重要前体化合物，再利用化学反应，连接上13位的侧链，即可得 到紫杉醇。白桦脂酸在实际生产中的来源主要有两类 一类是从天然植物中提取 的；另一类是化学合成的。白桦脂酸广泛分布于多种植物中，如五加科(刺 五加)、桦木科(白桦外皮)、鼠李科(酸枣仁)、柿科(白黑柿叶)等。 因此，早期的白桦脂酸提取大多采用直接提取法。然而，白桦脂酸在植物 中的含量很少，据文献报道在白桦树皮中也仅含有0.025%。用直接提取 法原料消耗量大，成本高，所得到的白桦脂酸杂质含量比较高，且不易除 去，无法满足商业需要。目前，以白桦脂醇为前体，经过化学合成法制备 白桦脂酸较多地应用于生产实践中，虽然合成效果较好，但存在操作复杂、 污染大、合成成本高、安全性低等问题，限制了其在实际中的应用。微生 物转化法合成白桦脂酸目前研究甚少，但其具有转化条件温和、转化效率 高、不良反应少、安全性高、生产成本低等优点，可预见其将会有非常好 的研究前景。有关白桦脂酸的生物法合成目前研究甚少，国外仅有一些关于白桦脂 酸及其衍生物的微生物转化研究，而国内研究则几乎空白。Denise等对白 桦脂酸和白桦脂酮酸进行了微生物转化研究。在研究中，两种化合物分别 经过来自悬铃木树皮的线虫捕捉菌、腔胞菌、暗色孢属，和来自玉米叶片 的刺盘孢四种微生物代谢转化。转化后产物经过特征表征，确定分子结构。 结果显示不同菌林生物转化白桦脂酸或白桦脂酮酸得到不同的衍生物， 且都是白桦脂酸或白桦脂酮酸的氧化产物。这表明这些真菌有利于羽扇烷 型结构物质在C-3， C-7, C-15, C-25和C-30位置有选择的氧化。另外， Parnali等研究了 ^ "7/m ATCC 13368菌种生物转化白桦脂酸得到4种相关衍生物。根据国外相关研究不难看出，通过微生物转化，白 桦脂酸能被成功氧化为多种衍生物，并且微生物种类不同可以氧化白桦脂 酸得到不同的衍生物。为此，如果筛选出合适的菌株能有利于白桦脂醇相6应碳位的氧化，实现微生物转化合成白桦脂酸，并能建立合适的转化体系 和方法，再利用发酵便可以获得大量白桦脂酸，这将为进一步研究白桦脂 酸及其衍生物的药理作用、临床实验，以及白桦脂酸的工业化生产奠定良 好基础，具有重要的理论价值和实际开发意义。
技术实现思路
本专利技术提供了 一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，利用黄绿蜜环菌ZJUQH将白桦脂醇生物转化成白桦脂酸，该方法操作 简单、转化条件温和、转化效率高、安全性高、成本低。本专利技术所4吏用的黄乡录蜜环菌(」nw7/^7'" /wteo-w>^w Sacc.) ZJUQH CGMCCNo 1884，在申请号为200610155189.7的中国专利技术专利申请中详细 描述了其获取、培养方法和形态，并发现其能在特定培养基与培养条件下 分泌多糖。该菌抹已经保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏日期2006年12月08日，保藏号CGMCC No l884。，包括(1) 向培养液中接入黄绿密环菌ZJUQH,得到预反应体系；(2) 向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液，于25 ~ 30 。C (优选28°C )转化反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括：　（１）向培养液中接入黄绿密环菌ＺＪＵＱＨ，得到预反应体系；　（２）向步骤（１）得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液，于２５～３０℃转化反应５～７天得到转化后的培养液；其中白桦脂醇用量以每升培养液计为０．０１～０．１ｇ；　（３）转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，刘婧，章海锋，何国庆，傅明亮，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]