本发明专利技术公开了一种生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括：（１）黄绿蜜环菌ＺＪＵＱＨ湿细胞的制备；（２）在离子液体或两相体系中加入黄绿蜜环菌ＺＪＵＱＨ湿细胞进行预培养，得到预培养体系；（３）向预培养体系中加入白桦脂醇溶液，于２５℃～３０℃发酵培养６小时～２４小时得到转化后的培养液；（４）转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸；其中，所述的两相体系为离子液体与正己烷的混合溶剂或者离子液体与磷酸缓冲溶液的混合溶剂。该方法与传统方法相比，提高了产物的得率，缩短了催化反应时间，且产物分离简单，同时离子液体体系不易挥发，生物相容性好，不污染环境。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种。
技术介绍
生物催化是利用酶或微生物细胞催化进行某种化学反应的过程，具有专一性强、 催化效率高、环境友好、操作条件温和等优点。与水相中的生物催化反应相比，非水相生物催化有其独特的优越性。但传统的有机溶剂通常会限制酶的活性和选择性，且会造成大量工业污染。离子液体(Ionic liquids, ILs)作为新型绿色溶剂，是由有机阳离子与无机阴离子或有机阴离子构成的盐类，在室温或较低温(< 100°c )下呈液态，具有可忽略的蒸汽压、 高热稳定性、高化学稳定性及对许多化合物具有良好的溶解性等特点，作为生物催化反应介质表现出许多优越性能，近年来引起广泛重视。2000年，Cull等首次报道了离子液体1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐( )/水双相体系中Iihodococcus R312细胞催化1，3_ 二氰基苯水解生成3-氰基苯酰胺反应，并发现 BF4)、1_ 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(Pig、l-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(BF4)、 1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(PF6)中的一种。可直接采用市售产品，如上海成捷化学有限公司生产的纯度> 99%的离子液体。步骤(3)中，所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，即溶剂为二甲基亚砜，其中的白桦脂醇浓度优选为7. 5mg/mL ；白桦脂醇用量优选以每升离子液体或含离子液体的两相体系计为75mg。所述的白桦脂醇可选用根据公开号为CN1013^201A中国专利申请中记载的从白桦树皮中提取得到白桦脂醇的方法而自行提取的白桦脂醇，纯度一般为90%，相比购买高纯度白桦脂醇标准样品作为催化底物更具现实意义，不但可以降低生产成本，还可以实现资源的综合利用。步骤(3)中，所述的发酵培养温度优选为^°C，发酵培养时间优选为18小时，一般可在转速180 220r/min (优选200r/min)的摇床上进行培养。步骤(1)中，活化所用的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其原料质量百分比组成为马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂3% ；所述的活化温度为25°C 30°C，活化时间为4天 6天。种子培养所用的种子培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，其原料质量百分比组成为马铃薯20%，葡萄糖2%，余量为水，pH自然；所述的种子培养温度为25°C 30°C，培养时间为3天，一般在转速为120r/min的摇床中进行培养。将活化后的黄绿蜜环菌ZJUQH制成黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液接入种子培养基，黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1 X IO6个/毫升 1 X IO7个/毫升，种子培养基与接入的黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为10 30。步骤O)中，所述的黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升离子液体或含离子液体的两相体系计为50g 400g，优选以每升离子液体或含离子液体的两相体系计为300g ； 所述的预培养条件为在25°C 30°C培养5分钟 15分钟，优选培养lOmin，一般可在转速180 220r/min (优选200r/min)摇床上进行培养。步骤(4)中，所述的后处理包括将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，调节pH至3 4，乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩得到白桦脂酸。调节pH值时可采用通用的酸、碱，如氢氧化钠、盐酸等。本专利技术方法中白桦脂醇、白桦脂酸含量同步检测方法为步骤⑷中转化后的培养液经后处理，用甲醇定容于IOml容量瓶，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC) 检测所得物中白桦脂醇、白桦脂酸的含量。RP-HPLC色谱条件色谱柱为Diamonsil C18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流动相为乙腈/水(体积比)=91/9 ；流速1. OmL/min ；检测波长210. Inm ；柱温25°C ；进样量10 μ 1 ；跑样时间30 45min。本专利技术具有如下有益效果本专利技术选择离子液体或含离子液体的两相非水相体系用于微生物整细胞催化白桦脂醇合成白桦脂酸，与采用普通水相体系相比，具有以下优点(1)离子液体或含离子液体的两相体系有利于提高转化效率和产物得率，白桦脂酸的产率可以达到12. 17%以上，相比普通水相体系提高了 30. 58% ； (2)离子液体或含离子液体的两相体系大大缩短了催化反应时间，转化时间不超过M小时；(3)离子液体或含离子液体的两相体系中产物分离简单，离子液体易于回收循环使用；(4)离子液体或含离子液体的两相体系不易挥发，生物相容性好，不污染环境，为白桦脂醇生物催化合成白桦脂酸产率的提高提供了新思路，同时为离子液体体系在白桦脂酸催化合成中的应用提供了理论依据。附图说明图1为本专利技术方法的流程示意图。具体实施方式实施例1 8不同两相体系中黄绿密环菌ZJUQH催化白桦脂醇合成白桦脂酸(1)将黄绿蜜环菌ZJUQH接入灭菌过的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(其原料质量百分比组成为马铃薯20%，葡萄糖2%和琼脂3% )，在观1，活化4天后制成黄绿蜜环菌 ZJUQH孢子悬浮液，然后接入马铃薯葡萄糖液体培养基(其原料质量百分比组成为马铃薯 20 %，葡萄糖2 %，余量为水，pH自然)，在、转速为120r/min的旋转式摇床中培养3天， 得到种子培养液。黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1 X IO6个/毫升，马铃薯葡萄糖液体培养基与接入的黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为30。将种子培养液经3000r/min冷冻离心30分钟，无菌水洗涤3次后除去发酵液获得黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞。(2)具塞试管中加入5mL离子液体与磷酸缓冲液的混合溶剂或离子液体与正己烷的混合溶剂形成两相体系，两相体系中离子液体的体积浓度为50%，无菌条件下加入上述黄绿密环菌ZJUQH湿细胞，黄绿密环菌ZJUQH湿细胞的用量以每升两相体系计为200g，于 ^°C，转速200r/min旋转式摇床上预培养lOmin，得到预培养体系。(3)向上述预培养体系中加入0. ImL浓度为7. 5mg/mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，继续于，转速200rpm旋转式摇床上发酵培养1 得到转化后的培养液。(4)将转化后的培养液经离心、调pH至3、乙酸乙酯萃取和旋转蒸发等后处理得到白桦脂酸。以bf4、pf6、bf4、pf6四种离子液体和磷酸缓冲液、正己烷两种溶剂分别组成两相体系进行白桦脂酸的催化合成，结果见表1 表 1权利要求1.一种，包括以下步骤(1)将黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens Sacc.) ZJUQH CGMCC No. 1884 经过活化和种子培养后得到种子培养液，再经冷冻离心得到黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No. 1884湿细胞；(2)在含有离子液体的两相体系中加入黄绿蜜环菌ZJUQHCGMCC No. 1884湿细胞进行预培养，得到预培养体系；(3)向预培养体系中加入白桦脂醇溶液，于25°C 30°C发酵培养6小时 M小时得到转化后的培养液；(4)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸；其中，所述的白桦脂醇用量以每升两相体系计为15mg 150mg;所述的两相体系为离子液体与正己烷的混合溶剂；所述的两相体系中添加有正丁醇，每升两相体系中正丁醇的添加量为0. 0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括以下步骤： （１）将黄绿蜜环菌ＺＪＵＱＨ经过活化和种子培养后得到种子培养液，再经冷冻离心得到黄绿蜜环菌ＺＪＵＱＨ湿细胞； （２）在离子液体或含有离子液体的两相体系中加入黄绿蜜环菌ＺＪＵＱＨ湿细胞进行预培养，得到预培养体系； （３）向预培养体系中加入白桦脂醇溶液，于２５℃～３０℃发酵培养６小时～２４小时得到转化后的培养液； （４）转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸； 其中，所述的白桦脂醇用量以每升离子液体或含有离子液体的两相体系计为１５ｍｇ～１５０ｍｇ； 所述的含有离子液体的两相体系为离子液体与正己烷的混合溶剂或者离子液体与磷酸缓冲溶液的混合溶剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，刘婧，傅明亮，何国庆，刘晓杰，章海锋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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