本发明专利技术公开了一种蝉拟青霉新菌株的人工培养及其镇痛化合物的提取与利用。本发明专利技术从自然界分离选育出生活力强、代谢活性物质产量高、质量好的蝉拟青霉新菌株ＡＰＣ－２０；提出利用该菌株进行产业化固体培养和／或液体培养进行发酵生产的方法；进而提出从该发酵产品中提取所含镇痛化合物及各有效部位与制备成多种剂型镇痛药物的方法；该化合物化学名称为Ｎ↑［６］－（２－羟乙基）腺苷，分子量３１１．２９７，分子式Ｃ↓［１２］Ｈ↓［１７］Ｎ↓［５］Ｏ↓［５］；用小白鼠扭体法测定有９９％的镇痛率。该化合物镇痛机理不同于目前常用的阿片类镇痛剂，不具有成瘾性，安全，具有较大的开发应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及虫草真菌发酵、有效部位提取及利用
，尤其是涉及一种蝉拟青霉新菌株APC-20的人工固体和/或液体发酵，从中提取出具镇痛活性的化合物并进而制备成镇痛药物。
技术介绍
蝉花自古以来是一种药用价值很高的珍贵中药材，它是由蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)(属虫草属)寄生于蝉若虫的复合体。以往人们主要采集稀有的天然蝉花用于各种保健品或作为配伍用药材以及滋补药膳。但天然蝉花已越来越少，且产量低，一年只能采收一次，同时产品质量受环境影响而参差不齐。自然界现有的蝉拟青霉菌存在有长势、产量、质量不一的问题，不能适应工业化生产的需要；并有文章报导认为(冯立马，上海应用技术学院学报(自然)2002年02期)，把该天然菌种直接用来进行人工固体培养发酵一般长不出子实体(孢梗束)；而用来工业化液体发酵时存在工艺不配套，菌丝体产量低，品质不佳等问题。这既不能满足中医临床用药对孢梗束的大量需求，也制约了对蝉拟青霉菌代谢产物的产业化深加工开发利用。虫草是一类重要的昆虫病原真菌，其代谢产物具有多样性及多种药理作用等特点，最早报道虫草对中枢神经系统有作用的是Brewster和Alsberg，他们给家兔及小鼠静脉或皮下注射冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sscc.)浸提液证明对中枢抑制有作用。国内张士善等也报道了冬虫夏草浸剂有镇静及催眠作用(张士善 药学学报，1991，26326-330)。本研究组陈祝安等报道蝉花及其人工培养物蝉拟青霉(Paecilomycec Cicadae)，以25g生药/Kg剂量注射小鼠腹腔可抑制由醋酸所致的扭体反应，镇痛率达95％以上，其效果相当于10mg/Kg吗啡(陈祝安等，蝉花的人工培养及其药理作用 真菌学报，1993，12138-144)。此外，细脚拟青霉(Paecilomyces teniupes(Peck)Samson)也有类似作用。李淑芳等报道用小鼠扭体法实验观察到，在所试古尼虫草(Cordyceps Gunnii(Berk.)Berk.)菌丝体浸提液，热板刺激法15小时后镇痛阈延长为79％，其镇痛强度与杜冷丁相似(李淑芳，鲍淑娟 贵阳医学院学报，1990，15(1)25～28)。虽然国内外报道了虫草及其无性型具有镇痛作用，但尚未揭示其镇痛作用的化学成分。张士善等研究认为冬虫夏草的镇静作用是由氨基酸，尤其是色氨酸所引起。朱振元报道古尼拟青霉(Paecilomyces Gunnii Liang)菌丝体镇痛作用的活性物质是分子量不高于12000的多肽(朱振元，梁宗琦，常胜军等 古尼虫草的生物活性物质I含肽镇痛组分的分离及性质 微生物学报2002。42(6)722～726)。国外也有报道从粉被虫草(Cordyceps pruinosa Petch)中分离提取到N6-(2-羟乙基)腺苷及其结构式，由于该化合物的特有性，已用它作为冬虫夏草制品的质量控制指标之一，其生物学用途一般作为Ca2+拮抗剂和肌肉收缩活性，但该化合物的镇痛作用未见报道(Tsutomu FuruyaN6-(2-HYDROXYETHYL)ADENOSINE，A BIOLOGICALLY ACTIVECOMPOUND FROM CULTURED MYCELIA OF CORDYCEPS AND ISARIASPECIES，Phytochemistry，Vol.22.No.11，pp.2509-2512，1983)。综上所述，有关蝉拟青霉的镇痛活性物质及其制备方法与利用尚未见报道，因此明确蝉拟青霉具镇痛作用的化学成分及其提取方法，进而开发成新型安全的镇痛药物具有重要的社会和经济效益。
技术实现思路
本专利技术针对上述不足，提出以下专利技术目的，一是从自然界分离并人工选育生活力强、代谢活性物质产量高、质量好的蝉拟青霉新菌株；二是研究提出利用该蝉拟青霉新菌株进行产业化固体培养和/或液体培养，生产高产、优质的孢梗束、菌丝体及其代谢产物与培养基混合物的制备方法；三是明确蝉拟青霉菌发酵产物中所含镇痛化合物的特性及其结构；四是提出从蝉拟青霉菌发酵产物包括孢梗束、菌丝体及其代谢产物与培养基的混合物中逐步提取具镇痛活性的各有效部位及其纯品的方法；五是进一步将以上提取物制备成多种剂型的镇痛药物。本专利技术目的是通过下述方案得以实现的。菌株的分离、选育、鉴定与保藏从浙江温州不同立地条件、不同生态环境采集标本，从中选择子实体大，孢梗束粗壮，无污染菌者进行分离纯化，分别予以编号，并进一步通过单孢分离方法，建立了25株菌株保存。其中从022009号起始菌中，分离选育到单孢优株APC-20菌株，经固体培养基发酵菌丝生长势，液体培养基菌丝体干重及多糖含量三个指标的测试表现最好，该菌株经中国科学院微生物研究所复核鉴定为蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)，并通过卫生部菌株安全性毒力实验为无毒安全菌株，该菌种在40％含水量的无菌土，4℃冰箱中保存544天未见失活。本专利技术的蝉拟青霉APC-20菌株已于2004年03月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO1104。蝉拟青霉APC-20菌株(CGMCC NO1104)具有以下微生物学特性1、形态特征(1)、孢梗束(蝉花)橙黄色，单生或成丛，30-50×2-5mm，顶尖或反复分枝成花菜状的头，并产生大量粉状分生孢子。(2)、菌株形态特征在PDA培养基上，菌丝灰白到浅黄，茸毛状。分生孢子梗分枝，78-203×2.9-50mm，通常2-5个瓶梗簇生于短枝上，成轮状排列。瓶梗基部近球形膨大，4.2-7(-13.5)×2.3-3.5(-5.2)mm，梗颈细长，向基式产生分生孢子链.分生孢子圆柱状或长卵形，无色单孢，壁光滑，3.5-9×1.5-3.7mm，少数弯曲。2、培养特征在PSA培养基上生长快，24℃培养14天，菌落直径60-72mm。菌丝体灰白或浅黄，茸毛状。有时表面出现轮纹或放射线。产孢后，菌落外貌显粉质状，背面无色，渗出液无色，水珠样。在Czapek培养基上生长慢而局限，14天直径为49-55mm。菌落平展，菌苔薄，灰白，茸毛状密致，背面无色，未见渗出液产生。在蛋白胨蔗糖琼脂上生长好，14天直径54-70mm。菌落表面有隆起环线，边缘有放射状沟纹，肉色，背面深褐色，未见渗出液。在麦粒或麸皮+玉米+谷糠等自然培养基上，菌丝体茸毛状至絮状，灰白至浅黄。15天形成菌核，并产生孢梗束。孢梗束掌状或圆柱状，橙黄色或蛋黄色，20-30×3-5mm，长的可达80cm。一般30天后产生大量分生孢子，以后孢梗束逐渐枯萎倒伏。3、碳，氮源利用(1)碳源利用 测定了葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖、甘油等10种C源，除菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖不能利用外，其余均能利用。但用葡萄糖作C源，孢子产量极显著高于其它C源(t＞t0.01)，用果糖作C源，菌丝体产量显著高于其它C源(t＞t0.05)。(2)氮源利用 测定了KNO3、NaNO3、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、NH4NO3、(NH2)2CO、NH4CL、NaNO2、H2NCSNH2含硝基、氨基、亚硝基等9种N源，以KNO3利用为好。但不本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蝉拟青霉新菌株ＡＰＣ－２０（ＣＧＭＣＣ ＮＯ：１１０４），其特征在于通过固体和／或液体发酵所产生的人工培养物与天然蝉花化学成份基本相同，并能提高其孢梗束和／或菌丝体的产量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柴一秋，韦忠民，陈祝安，厉晓腊，刘又高，王根锷，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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